Попытки отождествить архимандритов монастыря Иова, упомянутого в источниках в начале 1570 гг., и Ермогена, названного в источниках в конце 1570 – начале 1580 гг., с одноимёнными патриархами, вызывают у исследователей сомнения, поскольку в источниках, содержащих более подробные биографии этих патриархов («История о первом Патриархе Иове Московском», «Сказания о явлении и чудесах иконы Казанской Богоматери»), их связь с Московским Симоновым монастырём не отмечена. На основании записей Вкладной и кормовой книги исследователи предполагают, что число братии во второй половине XVI в. колебалось от 46 до 170 человек. В монастырских актах того времени упоминаются среди соборных старцев монастыря лица, ранее занимавшие настоятельские должности в Высоцком серпуховском в честь Зачатия Пресвятой Богородицы, Андрониковом в честь Нерукотворного образа Спасителя, Саввином Сторожевском в честь Рождества Пресвятой Богородицы, ярославском в честь Преображения Господня, рязанском в честь Преображения Господня, Мефодиевом Пешношском (Песношском) во имя святитея Николая Чудотворца и других монастырях («Акты феодального землепользования и хозяйства»). Московский Симонов монастырь функционировал как крепость и осенью 1606 г., когда отражал нападение войск Ивана Исаевича Болотникова, и во время польско-литовской интервенции (1610–1612 гг.). Монастырь содержал в своих стенах «осадных» и «ратных людей». Сведения из источников позволяют исследователям утверждать, что Московский Симонов монастырь не был взят. Исследователи предполагают, что монастырь использовался в качестве крепости и в 1616 и 1618 гг. В начале XVII в. монастырские власти поддерживали Лжедмитрия I, правящих государей Василия Ивановича Шуйского и Михаила Фёдоровича Романова и заняли враждебную позицию по отношению к интервентам. Источники фиксируют традицию пребывания государя в Московском Симоновом монастыре на праздник Происхождения Честных Древ (1 августа) во второй половине XVI – первой половине XVII вв. В богослужебных реформах и «деле Никона» монастырь активного участия не принимал, но поддерживал вышестоящие церковные и государственные власти. Участие Московского Симонова монастыря в этих событиях ограничилось присутствием настоятеля на церковных Соборах и содержанием под стражей противников Иоанна Неронова, Никиты Константиновича Добрынина. Вместе с тем среди братии находились и сторонники старообрядчества (старцы Серапион, Трифиллий). В 1680 гг. Московский Симонов монастырь возглавлял архимандрит Гавриил (Домецкий), литературный деятель и полемист, стремившийся к упорядочению монастырской жизни и составивший устав обители. В XVII в. некоторые настоятели монастыря получили архиерейский сан: Левкий (1634 г., Псковская кафедра), Иосиф (1642 г., Патриарх Московский и всея Руси), келарь Иосиф (?) (1657 г., Тверская кафедра), Мисаил (1667 г., Коломенская кафедра), Варсонофий (Чертков; 1671 г., Смоленская кафедра). В первой половине XVIII в. власть оказывала внимание монастырю: многие настоятели удостаивались архиерейской хиротонии (Рафаил (Краснопольский), 1708 г., Холмогорская кафедра; Дорофей (Короткевич), 1712 г., Смоленская кафедра; амвросий (Юшкевич), 1736 г., Вологодская кафедра; Лука (Конашевич), 1737 г., Великоустюжская кафедра).