Исследователи полагают, что такую позицию настоятелей Московского Симонова монастыря следует рассматривать как сознательный нейтралитет. Он отвечал интересам великих князей, желавших заручиться духовной и идеологической поддержкой церкви (в этом их могли поддержать иосифляне) и в то же время сконцентрировать в своих руках большой земельный фонд, в чём им была близка позиция нестяжателей, критиковавших монастырское землевладение. Московский Симонов монастырь сохранял связь с Иосифовым Волоколамским монастырём и в середине XVI в.; некоторые волоколамские насельники получали должности симоновских архимандритов (Чавва (Чёртый), Трифон (Ступишин) и Алексий (Ступишин)). Первые двое после настоятельства в Московском Симоновом монастыре стали архиереями. В середине XVI в. настоятели монастыря принимали участие в соборных заседаниях (о войне с Польшей, 1566 г.), в торжественных богослужениях (венчание великого князя Ивана IV Васильевича на царство, 1547 г.; поставление святого Гурия на Казанскую кафедру, 1555 г.; венчание на царство Фёдора Ивановича, 1584 г.). Настоятели Московского Симонова монастыря поддерживали центральную власть, проявлением чего было их участие в делегации к князю Андрею Ивановичу Старицкому с предложением подчиниться Москве, а также вступление «со всею вотчиною» в опричнину в 1569 г. («Полное собрание русских летописей», том 13). Архимандрит Иов сопровождал царя Ивана IV Васильевича в поездке в Новгород в начале 1570 гг. В свою очередь, царь жертвовал в монастырь имущество опальных; в частности, 11 октября 1569 г. «государевы бояре из опришнины… прислали… ковш серебрян Ивановской Хабарова». В начале 1580 гг. государь делал в монастырь денежные и вещевые вклады по царевичу Ивану Ивановичу, а также по опальным с предписанием их поминания. В XVI в., особенно во второй половине столетия, уменьшилось влияние Московского Симонова монастыря, а также несколько понизился его статус среди других обителей. Это проявилось в постепенном вытеснении на более удалённые места симоновских архимандритов в списках священнослужителей настоятелями других монастырей (в послании к князю Дмитрию Шемяке имя архимандрита Московского Симонова монастыря стоит первым после архиереев, а в летописной записи о поставлении Казанского архиепископа – шестым), в уменьшении количества совершённых архиерейских хиротоний насельников (при увеличении числа архиерейских кафедр и, следовательно, вакансий), в гневе Ивана IV Васильевича на симоновских монахов, зафиксированном в Послании в Кириллов Белозерский монастырь от 1573 г., доносе на симоновского архимандрита, составленном, скорее всего, в 1570 гг. и сохранявшемся в архиве Посольского приказа за 1626 г. В XVI в. архиереями стали архимандриты Вассиан (Санин; 1506 г., Ростовская кафедра), Варлаам (1511 г., митрополит Московский и всея Руси), Иоанн (?) (1520 г., Ростовская кафедра), Савва (1544 г., Крутицкая кафедра), Трифон (1549 г., Суздальская кафедра, позднее Полоцкая), Филофей (1562 г., Рязанская кафедра), Сильвестр (1599 г., Карельская кафедра).