В 1842 г. по инициативе архимандрита Димитрия (Муретова) Киево-Братский монастырь был причислен к первому классу, в обители возобновлена должность наместника, на которую назначался кто-либо из братии. Несмотря на единство управления, отношения между Киево-Братским монастырём и Киевской духовной академией не всегда были гладкими. В частности, на рубеже 1850 и 1860 гг. между обителью и академией возник спор из-за двух домов на территории Киево-Братского монастыря. В результате в 1862 г. по требованию Киевской духовной консистории было проведено чёткое размежевание монастырской и академической территорий. Киево-Братскому монастырю было отведено 467,5 кв. сажён. После введения в действие Устава духовных академий 1869 г. потребовалось существенное увеличение учебных площадей, а также создание новых квартир для профессоров. Ректор Киевской духовной академии и настоятель (1860–1877 гг.) Киево-Братского монастыря архимандрит Филарет (Филаретов) считал неудобным размещение на территории монастыря квартир для женатых профессоров и сотрудников Киевской духовной академии и потому предложил Совету Киевской духовной академии ходатайствовать перед Синодом о закрытии Киево-Братского монастыря с последующим приспособлением его зданий для нужд академии. Однако эта инициатива была решительно отвергнута Киевским митрополитом Арсением (Москвиным). В отношении в Синод митрополит Арсений (Москвин) писал, что «одну мысль о закрытии Киево-Братского монастыря, столь знаменитого своей древностью и своими великими заслугами на пользу Церкви и Отечества» он считает «неблаговидной и неблагоприятной для общественного мнения». В результате корпус с квартирами для преподавателей (1872 г.) был построен вне монастырских стен. C 1874 г., когда архимандрит Филарет был хиротонисан во епископа Уманского, викария Киевской епархии, последующие настоятели Киево-Братского монастыря также имели епископский сан. Штат Киево-Братского монастыря состоял из настоятеля, наместника, восьми иеромонахов, четырёх иеродиаконов, трёх монахов и пяти послушников. Однако реальное количество братии, как правило, не совпадало со штатным. Так, в 1913 г. в братии состоял 31 человек (епископ, архимандрит, девять иеромонахов, восемь иеродиаконов, 12 монахов). Часть братии составляли вдовые клирики. Вместе с келейниками и сотрудниками число насельников на рубеже XIX и XX вв. обычно составляло около 60 человек. Начало Первой мировой войны принесло серьёзные испытания в жизнь насельников. В сентябре-октябре 1915 г. монахи были эвакуированы в казанские Иоанновский и Преображенский монастыри, откуда вернулись в Киев в 1916 г. Во время отсутствия братии обязанности настоятеля монастырского храма выполнял протоиерей Александр Глаголев. При этом часть монастырских зданий была реквизирована на военные нужды. В Киево-Братском монастыре существовали особые богослужебные традиции. Среди киевлян известность приобрели пассии, служившиеся в первые четыре пятницы Великого поста, и обряд перенесения вербы, совершавшийся в Лазареву субботу. Во время пассий в монастырских храмах произносили проповеди профессора Киевской духовной академии.