Исследователи не исключают, что Киево-Братский монастырь возник уже после основания братства, т.к. братская Богоявленская церковь впервые упоминается только в 1620 г. как «новозаложенная». Первый известный список членов Киевского Богоявленского братства датирован 4 января 1616 г., следовательно, братство и обитель существовали до указанной даты. В том же году киевский мещанин Василий Фёдорович Ходыка (Кобызевич) дал на «дом школьный в Киеве» 10 коп. (исследователи полагают, что в его завещании речь шла о школе, основанной Киевским братством и Киево-Братским монастырём). Весной 1620 г. Иерусалимский  патриарх Феофан IV посетил Киев, несколько месяцев проживал в обители. 6 октября 1620 г. в монастырской Богоявленской церкви патриархом Феофаном, Софийским митрополитом Неофитом и Стагонским епископом Авраамием во епископа Перемышльского и Самборского был тайно хиротонисан иеромонах Исаия (Копинский). Это была первая епископская хиротония, совершённая Иерусалимским патриархом для восстановления иерархии Западнорусской митрополии. 9 октября в монастырской Богоявленской церкви патриарх Феофан совершил архиерейскую хиротонию и возвёл в сан митрополита Иова (Борецкого), игумена киевского Михайловского Златоверхого монастыря. Особой грамотой патриарх благословил деятельность братства и школы при Киево-Братском монастыре. В грамоте патриарха от 7 января 1621 г. Киевскому братству и Киево-Братскому монастырю были предоставлены права ставропигии Константинопольского патриарха. Не позднее 1620 г. ктитором Киево-Братского монастыря стал запорожский гетман Петро Конашевич Конашевич-Сагайдачный, пожертвовавший не позднее 10 апреля 1622 г. на нужды монастыря значительные суммы и впоследствии похороненный рядом со строившимся каменным собором в честь Богоявления. По преданию, он же пожертвовал для монастырской церкви серебряный крест, хранившийся в соборе обители. 10 апреля 1625 г. царю Михаилу Фёдоровичу Романову, а также думному дьяку Ивану Тарасьевичу Грамотину было отправлено «письмо духовных и мирских братий», в котором содержалась просьба «о милостыни на украшение своей церкви Богоявления Господня, Благовещения и преподобных Антония и Феодосия Печерских». 17 января 1626 г. обращение с просьбой о выделении помощи Киево-Братскому монастырю и школе поступило к царю Михаилу Фёдоровичу. Среди первых настоятелей Киево-Братского монастыря исследователям известны: в 1628 г. – иеромонах Серапион (Бельский), в 1630–1631 гг. – иеромонах Тарасий (Земка), в 1631–1632 гг. – иеромонах Фома (Иевлевич). В 1630 г. в Киеве свирепствовала эпидемия моровой язвы, часть насельников скончались. Новый этап в жизни Киево-Братского монастыря начался после подписания архимандритом Петром (Могилой) и Киевским братством акта об объединении Киево-Печерской школы и школы, располагавшейся в Киево-Братском монастыре. В соответствии с этим договором Пётр (Могила) становился главным братчиком и защитником объединённой школы. В начале 1632 г. объединение школ было подтверждено Киевским митрополитом Исаией (Копинским) и гетманом Иваном Давыдовичем Петражицким-Кулагой. 5 июня решение об объединении Печерской и Братской школ утверждено митрополитом Киевским Исаией (Копинским). При этом митрополит потребовал, чтобы за богослужением в Киево-Братском монастыре поминалось имя Киевского митрополита. Данная мера должна была подчеркнуть, что объединённая школа находится в его юрисдикции.