В посольстве конца 1639 – 1640 гг. в Москву участвовал настоятель Киево-Братского монастыря игумен Леонтий (Бронкевич). Братия просила царя пожертвовать обители иконы, церковные сосуды, облачения, книги (Евангелие, Устав, Минеи на 12 месяцев), а также средства на ремонт. Игумену Леонтию было выдано 100 руб. «на всякое церковное и монастырское строение». 3 апреля 1640 г. на приёме у царя Михаила Фёдоровича глава посольства наместник Киево-Печерский Игнатий (Оксенович-Старушич) предложил основать в Москве обитель, в которой бы старцы и братия из Киево-Братского монастыря «детей боярских и простого чину грамоте греческой и славянской учили». В обращении к царю посол писал: «Яко милосердый царь и светило всему православному роду российскому, по воли своеи государской сотвори, а отец митрополит Киевский государскую волю вскоре исполнит и старцов со учителми пришлёт». При игумене Иннокентии (Гизеле) в 1646–1650 гг. земельные владения Киево-Братского монастыря расширились. В 1647 г. скарбник киевский Данил Юрий Воронич записал обители Соляниковский пляц, а в 1649 г. польский король Ян II Казимир подтвердил право Киево-Братского монастыря на имения Крестовоздвиженской и Трёхсвятительской церквей. В июне 1649 г. игумен Иннокентий (Гизель) направил из обители в Москву учёных иеромонахов Арсения Сатановского (Корецкого) и Епифания (Славинецкого). Вместе с другими посланиями они привезли царю Алексею Михайловичу письмо с просьбой о выделении милостыни. В ответ в Киев были отправлены 200 руб. и царская жалованная грамота с позволением монахам Киево-Братского монастыря приезжать в Москву за милостыней раз в пять лет. 30 августа 1650 г. по ходатайству старцев Арсения и Епифания игумену была послана новая жалованная грамота с разрешением приезжать за милостыней раз в три года. Положение Киево-Братского монастыря ухудшилось после начала национально-освободительной войны под предводительством Богдана Михайловича Хмельницкого. Так, уже в 1648 г. в ходе боевых действий польские войска разорили местечко Новосёлки, принадлежавшее обители. В 1650–1657 гг., при игумене Лазаре (Барановиче), Киево-Братский монастырь вновь расширил свои владения, но одновременно понёс убытки в связи с постоянными военными действиями: летом 1651 г. Киево-Братский монастырь был разграблен во время вступления польских войск в Киев. 11 января 1651 г. Богдан Хмельницкий передал обители село Мостище, бывшее имение упразднённого Киевского доминиканского монастыря (подтверждено грамотой киевского полковника Василия Фёдоровича Дворецкого от 3 мая 1659 г.), 9 января 1656 г. – сёла Ксаверов, Мухоеды, Плисецкое (Плесецкое), Черногородка, Сарновичи, Обиходы и Базар. С 1658 по 1665 гг. игуменом Киево-Братского монастыря был Иоанникий (Галятовский). Во время его игуменства гетман Иван Евстафьевич Выговский заключил с Польшей Гадячский договор, что повлекло войну с Москвой. Киев оказался в эпицентре боевых действий, в разорённом Киево-Братском монастыре сгорели документы, подтверждавшие его права на владения. Игумен Иоанникий занимался ликвидацией последствий пожара. Благодаря его ходатайствам киевский полковник В.Ф. Дворецкий универсалом от 3 мая 1659 г. восстановил сгоревшие грамоты на владения.