Сосуществование Киево-Братского монастыря и Киево-Могилянской коллегии не всегда было мирным. Часть доходов от имений монастырь выделял на содержание преподавательского состава, и преподаватели неоднократно требовали увеличения расходов обители. Так, в 1751 г. братия жаловалась митрополиту на настоятеля архимандрита Сильвестра (Ляскоронского), который бесконтрольно тратил монастырские суммы на содержание профессоров, а монахам не обеспечил ни достойного содержания, ни качественного питания. Другой конфликт возник в 1759–1760 гг., когда архимандрит Давид (Нащинский) по требованию братии пытался урезать расходы на материальное содержание преподавателей. По жалобам преподавателей решением Киевского митрополита он был уволен как с должности ректора, так и с должности настоятеля и переведён в Гамалиевский Харалампиевский монастырь. Конфликты между братией и академической корпорацией прекратились лишь около 1774 г., когда Киевские митрополиты стали лично распределять монастырские доходы между обителью и Киево-Могилянской коллегией. 10 апреля 1786 г. был издан указ императрицы Екатерины II о секуляризации монастырских имений в пределах Киевской митрополии. Киево-Братский монастырь был закрыт. Одной из причин упразднения была объявлена его «малобратность» и то, что он являлся «придатком» коллегии. В 1786 г. в Киево-Братском монастыре проживали 19 монашествующих и белый священник на правах послушника. Вместе с келейниками и прислугой количество насельников составляло около 50 человек. К моменту закрытия в монастыре было три церкви: соборная Богоявленская, конгрегационная Благовещенская и трапезная Борисоглебская. Обители также принадлежал гостиный дом с двумя погребами. Монастырская территория была обнесена оградой, частично каменной. В связи с тем что в 1795 г. сгорел Гамалиевский монастырь, обсуждался вопрос о переводе гамалиевских насельников в другую обитель. 6 февраля 1799 г. настоятелем Гамалиевского монастыря стал учитель богословия Киево-Могилянской коллегии архимандрит Ириней (Фальковский), который предложил Киевскому митрополиту Иерофею перевести братию Гамалиевского монастыря в Киев, в пустовавшие корпуса Киево-Братского монастыря. 21 марта 1799 г. митрополит Иерофей обратился в Синод с просьбой утвердить перенесение мужского монастыря из Гамалиевки в Киев и разрешить восстановление Киево-Братского монастыря. 23 мая 1799 г. Синод утвердил данное решение, Киево-Братский монастырь был восстановлен и отнесён ко второму классу. В августе 1799 г. утварь и ризница были перевезены из Гамалиевки в Киев. С 1803 г. настоятель Киево-Братского монастыря архимандрит Ириней (Фальковский) также являлся и ректором академии. В 1804 г. настоятелем Киево-Братского монастыря был назначен архимандрит Иакинф (Логановский). При нём 9 июля 1811 г. на Подоле был сильный пожар, который опустошил Киево-Братский монастырь. Все деревянные постройки обители сгорели, от большинства каменных зданий остались лишь остовы. Два купола Богоявленского собора обрушились, и стало невозможно совершать в нём богослужения. Расплавились даже колокола на монастырской колокольне.