Политика Карла сначала строилась с учётом династических и политических интересов княжеской элиты, однако лавирование между Папским престолом, союз с которым был необходим ввиду противостояния с Францией в Итальянских войнах, и немецкими князьями носило исключительно тактический характер. В конце ноября 1520 г. Карл обещал выступить третейским судьёй в деле Мартина Лютера. Буллой «Decet Romanum Pontificem» от 3 января 1521 г. папа Римский Лев X отлучил Мартина Лютера от церкви. Однако император в соответствии с обещанием, данным курфюрстам, предоставил Мартину Лютеру охранную грамоту, чтобы он прибыл на рейхстаг в Вормс, изложил своё учение и отрёкся бы от него. Мартин Лютер выступил на рейхстаге, но признать свои идеи ошибочными отказался. 8 мая император одобрил, а после окончания рейхстага подписал Вормсский эдикт (25 мая 1521 г.): Мартин Лютер был объявлен еретиком и поставлен вне закона, запрещалось исповедовать его учение, читать и распространять его сочинения, предписывалось преследовать на всей территории империи сторонников новой ереси. Вормсский эдикт, по мнению Карла, должен был умиротворить Германию, однако в действительности стал началом конфессионального раскола империи. Тот факт, что документ не получил одобрения рейхстага, давал формальный повод для его невыполнения. Под реформационными лозунгами проходило в 1522–1523 гг. так называемое Рыцарское восстание. Возглавивший его немецкий рыцарь Франц фон Зиккинген, сторонник лютеранства, в августе 1522 г. начал поход против одного из влиятельнейших германских духовных князей – архиепископа и курфюрста Трирского Рихарда фон Грейффенклау, чтобы свергнуть его, а затем и других светских и духовных князей, якобы поделивших между собой Германию, и создать единое германское государство, подчинённое одному главе. В 1524–1526 гг. почти все земли империи были затронуты Крестьянской войной. Распространение Реформации и Крестьянская война порождали неясность религиозной и политической ситуации. Не только миряне, но и многие приходские священники и клирики жаловались на неспособность церковных иерархов и властей предотвратить раскол. По решению рейхстага, проходившего летом 1526 г. в Шпайере под руководством Фердинанда, младшего брата Карла, князьям было разрешено действовать в церковных вопросах по своему усмотрению, «как каждый считает возможным для того, чтобы держать ответ перед Богом и его величеством императором», что фактически приостанавливало действие Вормсского эдикта и давало князьям право самим определять как свою веру, так и веру своих подданных. Протестантскими стали курфюршество Саксонское, Пруссия, Гессен и ряд других имперских княжеств и городов. В 1529 г. католическое большинство собравшегося в Шпайере рейхстага заявляло о необходимости строгого исполнения Вормсского эдикта и применения санкций против лютеран, однако шесть князей и 14 имперских городов подписали протест, в котором выразили несогласие с решением рейхстага. Длительное отсутствие Карла в Германии способствовало расширению реформационного движения. Завершив войну с Францией подписанием мира в Камбре (август 1529 г.), в 1530 г. он вернулся в Священную Римскую империю.