В 1535 г., будучи в Испании, император объявил крестовый поход против турок и набрал армию в 30 тыс. человек. Заключив союз с Генуей и Мальтийским орденом (в 1530 г. Карл V как король Сицилии передал во владение Ордену острова Мальта и Гоцо, а также североафриканский порт Триполи, ныне столица Ливии), он получил в распоряжение мощный военный флот и переправил войска в Тунис, завоёванный турками годом ранее. После продолжительной осады христианская армия захватила город Тунис и порт Голетта, где Карл V приказал возвести фортификационные сооружения. В 1538 г. Карл V вступил в Священную лигу, объединившую силы Венеции, Генуи, Папского государства и Священной Римской империи. Однако союзный флот был разгромлен численно уступавшей ему флотилией Сулеймана I в битве при Превезе (28 сентября 1538 г.). Дальнейшие попытки Карла V отвоевать североафриканское побережья (в частности, война за Алжир в 1541 г.) были безуспешными. Удачей дипломатии Карла V стал договор с иранскими правителями из династии Сефевидов, которые отказывались признавать за османами Восточную Анатолию и территорию современного Ирака. Противоречия между мусульманскими державами, умело использованные императором, привели в 1532 г. к началу войны, которая в итоге создала более благоприятный фон для мирных переговоров Карла V и Сулеймана I. После поражения в Алжире императору удалось добиться перемирия (1542 г.). В 1540 гг., после смерти венгерского короля Яноша I Запольяи, возобновились военные действия на Балканах: в 1541 г. под предлогом защиты прав законного наследника, малолетнего Яноша II Жигмонда, турки захватили Буду и Пешт, в 1543 г. – Секешфехервар и другие крупные города. Командовавший имперскими войсками Фердинанд I не мог противостоять турецкой армии, и султан, не желавший продолжения боевых действий на Балканах в условиях войны с Сефевидами, принудил Карла V и Фердинанда к перемирию. В подписанном 19 июня 1547 г. в Адрианополе (Эдирне) мирном договоре Карл V был назван «королём испанским», т.е. единственным императором признавался Сулейман I. Договор узаконил завоевания турок в Венгрии, король Фердинанд I сохранил лишь западные комитаты королевства – от Хорватии до Верхней Венгрии (ныне территория Словакии) и обязался платить за них султану ежегодную дань. Недовольный неудачами своей политики и религиозными уступками, на которые он вынужден был пойти в Германии, ещё осенью 1555 г. Карл V говорил о намерении сложить коронные регалии, но из политических соображений и по настоянию брата публично объявил свою волю в 1556 г.: 16 января он отрёкся от испанской короны в пользу своего сына Филиппа II, 5–7 сентября – от императорской короны в пользу брата Фердинанда I. После отречения Карл V уединился в монастыре Ордена иеронимитов Сан-Херонимо-де-Юсте в Эстремадуре. Вёл переписку по вопросам политики с Филиппом II, среди его приближённых был Луис де Авила-и-Суньига, главный командор Ордена Алькантара и автор «Комментария о немецкой войне, которую вёл Карл V, великий римский император, король Испании, в 1546 и 1547 годах» (1548 г.). Как христианин, Карл V оставался верным католиком и был дисциплинирован в обрядовых вопросах. Смирение в отречении от власти, а также духовные поиски в последние годы жизни породили слухи о том, что он стал монахом Ордена иеронимитов. Умер от малярии. В 1574 г. его останки были перезахоронены в королевской усыпальнице в Эскориале (ныне в городе Сан-Лоренсо-де-Эль-Эскориаль, провинция Мадрид).