В 1507–1518 гг. Коломенскую епархию возглавлял Митрофан, бывший архимандрит Андроникова в честь Нерукотворного образа Спасителя монастыря и духовник великого князя Ивана III Васильевича, состоявший в переписке с Иосифом Волоцким. Близок великому князю Василию III Ивановичу и митрополиту Даниилу был и епископ Вассиан (Топорков), поставленный на Коломенскую кафедру в 1525 г. из соловецких игуменов. При епископе Вассиане (Топоркове) в Коломне по повелению великого князя была построена мощная кирпичная крепость (1525–1530 гг.), ставшая южным форпостом Российского государства. У исследователей есть основание полагать, что при епископе Вассиане (Топоркове) в состав Коломенской епархии вошёл Каширский уезд: в августе 1538 г. Коломенской епархии была выдана тарханная грамота, освобождавшая от уплаты налогов слободы в Коломне; Вассиан (Топорков) назван в этой грамоте епископом Коломенским и Каширским. После включения Каширского уезда в Коломенскую епархию должен был перейти Белопесоцкий во имя Святой Троицы монастырь, значительная духовная корпорация того времени. Грамота 1538 г. была подтверждена в 1551 г., что являлось актом особой милости, поскольку в 1550 г. в Судебник вошло установление о ликвидации «тарханов». В первой половине XVI в. несколько Коломенских архиереев оставили кафедру, что, по мнению исследователей, было связано с церковными и политическими спорами и борьбой в эти годы. Коломенский епископ Тихон, бывший игумен Кириллова Белозерского в честь Успения Пресвятой Богородицы монастыря, близкий сочувствовавшему нестяжателям митрополиту Варлааму, после 1522 г. в источниках не упоминается (как полагают исследователи, был смещён новым митрополитом Даниилом). В мае 1542 г., вскоре после прихода на митрополию Макария и переворота бояр Шуйских, был смещён с Коломенской кафедры епископ Вассиан (Топорков). Его сменил архимандрит Новоспасского московского в честь Преображения Господня монастыря Феодосий, удалённый из епархии в 1555 г. Царь Иван IV Васильевич Грозный позднее обвинял руководителей «Избранной рады» (неофициального правительства России в годы реформ) в том, что они побуждали население Коломны «камением побити» епископа, а затем «со престола согнали». Летом 1552 г. епископ Феодосий благословил в коломенском Успенском соборе Ивана IV Васильевича, прибывшего в город с войском для отражения крымско-татарского набега. Перед началом похода на Казань в том же году царь вновь взял благословение у Феодосия возле Донской иконы Божьей Матери, которая находилась в коломенском кафедральном храме. Во время пребывания в Коломне царь Иван IV и епископ заложили шатровую Успенскую церковь (см. Брусенский в честь Успения Божьей Матери женский монастырь). В ноябре 1562 – 1563 гг. Коломенский епископ Варлаам II сопровождал Ивана IV в походе на Полоцк, взяв с собой чудотворную Донскую икону, благословлял его и русское войско. В 1581–1586 гг. епископом Коломенским и Каширским был первый патриарх Московский и всея Руси Иов. Не раньше 1447 г. территория Коломенской епархии, по предположению историка церкви Ивана Михайловича Покровского, «успела перейти за Оку и расширилась за счёт земель старой Чернигово-Северской области», что стало следствием заключения в 1483 г. московско-рязанского договора.