9 мая 1845 г. кафедра Литовского архиерея, в 1839–1845 гг. находившаяся в жировицком в честь Успения Пресвятой Богородицы монастыре, была перенесена в Вильну, кафедральным собором стала церковь святителя Николая. В 1840 г. было создано Брестское викариатство Литовской епархии для управления приходами на территории Гродненской губернии. В 1843 г. в Литовскую епархию вошла территория новообразованной Ковенской губернии, и было учреждено Ковенское викариатство. До начала 1860 гг. епархия практически не получала средств из российской казны на строительство храмов, местные ресурсы не позволяли осуществлять его в нужном объёме. Положение в корне изменилось после подавления польского восстания 1863–1864 гг., когда многие костёлы и католические монастыри «за содействие мятежникам» главным начальником края Михаилом Николаевичем Муравьёвым-Виленским были переданы в распоряжение православной епархии или закрыты. В 1860 гг. российская казна выделила 500 тыс. руб. на строительство 57 храмов в Литовской епархии, кроме того, со всех концов России в край поступали пожертвования. В 1865–1869 гг. были восстановлены древние храмы Вильны, построенные в XIV в.: Успенский митрополичий собор (Пречистенский), церковь великомученицы Параскевы Пятницы, церковь святителя Николая, к которой пристроили часовню в честь архангела Михаила, в 1851 г. в Свято-Духове монастыре в существовавшей раньше пещере была оборудована церковь во имя Виленских мучеников Антония, Иоанна и Евстафия, где поместили мощи этих святых, вновь обретённые в 1814 г. К концу 1860 гг. на территории епархии действовало больше 450 православных храмов. При архиепископе Макарии (Булгакове; 1868–1879 гг.), сменившем на кафедре митрополита Иосифа, в епархии были построены и переделаны в православные 293 приходские церкви. Архиепископ Макарий (Булгаков) ввёл выборность благочинных, при нём регулярно проходили епархиальные, благочиннические и училищные съезды. В 1898 г. Литовскую кафедру занял архиепископ Ювеналий (Половцев), придававший большое значение устроению монашеской жизни. По его ходатайству перед Синодом в 1901 г. был возрождён Березвечский в честь Рождества Пресвятой Богородицы женский монастырь, значительно увеличилось число насельников виленского Свято-Духова монастыря, священноархимандритами которого были Виленские архиереи. В 1909 г. при виленском православном Свято-Духовском братстве был учреждён церковно-строительный комитет, который взял на себя заботу по организации сбора средств на храмоздательство в епархии. В 1899 г. в связи с учреждением Гродненской кафедры (см. Гродненская и Волковысская епархия) территория Гродненской губернии была исключена из Литовской епархии, прекратило существование Брестское викариатство. Во время управления Литовской епархией архиепископом Тихоном (Беллавиным; декабрь 1913 г. – июнь 1917 г.; впоследствии Патриарх Московский и всея России) была открыта церковь при штабе военного корпуса в Вильне, заложена церковь во имя апостола Андрея Первозванного в селе Андроны Дисненского уезда, построены храмы в Дисне и в местечке Угорско-Богинское (Богино).