С начала 1340 гг. Мистра стала одной из опорных баз в гражданской войне за византийский престол. В 1349 г., став императором, Иоанн Кантакузин направил в Мистру младшего сына Мануила, даровав ему титул деспота. Тем самым был образован Морейский деспотат – феодальное владение в составе Византии, в которое помимо Мистры вошла бо́льшая часть Пелопоннеса. В 1352 г. победивший в гражданской войне в Византии император Иоанн V Палеолог попытался изгнать Мануила из Мистры и назначил деспотами Мистры Михаила и Андрея Асеней, сыновей Андроника Палеолога Асеня. Однако в начавшейся вновь гражданской войне Мануил отстоял свои владения; Иоанн V вынужденно признал его фактический суверенитет. Мистра надолго оказалась почти полностью не зависимой от Константинополя. Мануил правил в Мистре до смерти в 1380 г. Около 1361 г. в Мистру перебрался Иоанн Кантакузин со старшим сыном Матфеем, окончательно потерпевший поражение в борьбе за византийский престол и отказавшийся от политической карьеры. Приняв монашество с именем Иоасаф, он провёл последние десятилетия жизни в Мистре и умер в 1383 г. В 1381–1382 гг. официальным правителем Мистры был Матфей Кантакузин. Преемником Кантакузинов в Мистре стал Феодор I Палеолог, сын императора Иоанна V. С этого времени Мистра вновь вошла в сферу влияния Константинополя, однако её военно-политическое положение стало ухудшаться. В 1394 г. Мистра и Морея были оккупированы войском турок-османов. Под давлением султана Баязида Феодор вынужден был фактически стать его вассалом. В 1397 г. Морея подверглась нападению османских полководцев Якуб-паши и Тимурташа. Пытаясь найти спасение от разграбления, Феодор отправился из Мистры на Родос, где начал переговоры с Орденом госпитальеров о продаже некоторых своих владений крестоносцам. Спустя несколько лет, около 1400 г., был заключён договор о продаже большей части Мореи, включая Мистру и ряд других крепостей и портов. Однако жители Мистры во главе с митрополитом заявили о готовности поднять восстание в случае реализации этой сделки и начали нападать на крестоносцев, появившихся в городе. Желая предотвратить кровопролитие, архиерей обратился к горожанам с просьбой дать латинянам три дня на то, чтобы покинуть Мистру, что и было исполнено. Эта тупиковая политическая ситуация разрешилась после разгрома турок войском Тимура под Анкарой в 1402 г. Положение всех византийских владений, в том числе Мистры, на время укрепилось. Феодор Палеолог вернулся в Мистру, расторг договор с госпитальерами и вернул им ранее выплаченные ему деньги. После смерти Феодора в 1407 г. правителем Мистры с одобрения Константинополя стал его малолетний племянник Феодор II, сын императора Мануила II Палеолога, его опекуном был назначен Мануил Франкопул, присланный из Константинополя. Возмужав, Феодор II управлял Мистрой до 1443 г. В 1421 г. Феодор женился на Клеофе, дочери правителя Анконской марки из рода Малатеста; свадьбу праздновали в Мистре. В первой половине XV в. по мере дальнейшего ухудшения положения Константинополя значение Мистры в государственной системе Византии росло. Город на время превратился в некое подобие второй столицы империи. В 1415–1416 гг. в Мистре около года прожил император Мануил II. После его возвращения в Константинополь фактическим правителем Мистры стал его соправитель Иоанн (см. Иоанн VIII Палеолог).