В 1942–1944 гг. на территории ботанического сада Киевскому Ионинскому во имя Святой Троицы мужскому монастырю принадлежал скит в честь иконы Божьей Матери «Знамение», настоятельницей которого была монахиня Мамелфа (Енакоева). В 1944 г., перед закрытием, в скиту проживало 39 монахинь и послушниц, многие из них исполняли послушание «садовниц» в ботаническом саду (Центральный государственный архив гражданских объединений Украины). В 1991 г. на бывшей территории Киевского Ионинского во имя Святой Троицы мужского монастыря возобновились богослужения: община во главе с игуменом Агапитом (Бевциком), первоначально зарегистрированная по адресу частной квартиры на ул. Киквидзе (как скит Киево-Печерской лавры), молилась перед закрытой Троицкой церковью. На постройки обители претендовала греко-католическая община Киева, которая в 1991–1992 гг. также совершала богослужения перед храмом. 25 ноября 1992 г. игумену Агапиту удалось добиться разрешения на совершение богослужений в храме; в тот же день была отслужена первая литургия. В середине 1990 гг. на территорию обители претендовала зарегистрированная в 1992 г. Киевским горисполкомом по адресу резиденции Киевского митрополита Филарета (Денисенко) община «Ионинского мужского монастыря УПЦ-КП», которую возглавил «архимандрит» Изяслав (Юрий Анатольевич Карга). Однако благодаря совместным усилиям братии и прихожан обитель удалось сохранить в ведении канонической церкви. Архимандрит Спиридон (Лукич; ум. 2 сентября 1991 г.), начинавший свой монашеский путь послушником Киевского Ионинского во имя Святой Троицы мужского монастыря в начале ХХ в., дожил до начала возрождения обители, в 1990–1991 гг. служил духовником Киево-Печерской лавры. До 1995 г. Киевский Ионинский во имя Святой Троицы мужской монастырь был скитом лавры. В 1995 г. монастырю был возвращён статус самостоятельного. В 1996 г. Госкомитет Украины по делам религий официально зарегистрировал Киевский Ионинский во имя Святой Троицы мужской монастырь по его прежнему адресу, на территории ботанического сада. В Киевском Ионинском во имя Святой Троицы мужском монастыре был построен келейный корпус, восстановлена трапезная. Рядом со старой «часозвоней», находившейся в аварийном состоянии, поставлена её точная копия, на которую перенесены старинные часы. По соседству оборудована временная деревянная звонница; к первому колоколу, висевшему ещё на соборной звоннице, прибавились новые большие колокола. Восстановлен Троицкий собор. Ещё на рубеже 1970 и 1980 гг. художниками «Укрреставрации» с рушившегося потолка главного объёма Троицкого храма была снята композиция «Покров Пресвятой Богородицы». В 1996 г. под руководством Н.А. Романченко в храме проводились реставрационные работы. Среди сохранившихся живописных композиций – «Троица Ветхозаветная», «Троица Новозаветная» и образы четырёх евангелистов (в барабане главного купола), изображения святых в верхней части стен центрального нефа, сюжет «Сотворение мира» в боковых нефах, две композиции «Собор Пресвятой Богородицы и всех святых» – над южной и северной дверями, представляющие явления преподобному Божьей Матери с сонмом святых, сюжеты «Нагорная проповедь» (в приделе Всех святых), «Отшествие преподобного Антония с Афонской горы на подвиги в Киев» (в Троеручицком приделе), «Поражение ангелом Евагрия за непримирение с преподобным Титом Печерским», «Распятие» и «Сошествие во ад» (в притворе).