25 июля 1933 г. решением президиума Киевского горсовета келейный корпус с хозяйственными постройками был передан в ведение трудовой школы. В том же году были арестованы архимандрит Иов, иеросхимонах Алексий (Щур) и десятки монахов. 15 февраля 1934 г. решением президиума Киевского горсовета был закрыт Троицкий храм. При закрытии церкви был арестован иеромонах Паисий, один из последних насельников, нелегально служивший и проповедовавший на территории обители (Центральный государственный архив гражданских объединений Украины). До середины 1930 гг. были репрессированы последние насельники: монахи Архип (Мельников), Гедеон (Матвейченко), Иеремия (Рощак), Михаил (Тарасенко), Арсений (Дудник) и Тихон (Алексиенко). Небольшая часть монашествующих, опасаясь репрессий, перешла за 100-километровую запретную для проживания «антисоветского элемента» зону, в посёлок Малин (ныне город Житомирской области). Здесь под началом иеромонаха Геронтия (Носенко) иноки организовали общину, члены которой в 1937 г. были репрессированы. Один из клириков обители, иеромонах Полихроний (в схиме Прохор; Дубровский), после освобождения из-под ареста в 1935–1937 гг. служил настоятелем церкви в местечке Носовка (ныне город Черниговской области), затем был вновь репрессирован, а после 1941 г. служил в Киево-Печерской лавре. В 1942 г. монастырская община в Киевском Ионинском во имя Святой Троицы мужском монастыре была восстановлена. Братию возглавил архимандрит Иадор (Лось), благочинным стал иеромонах Галактион (Репник). Одновременно в 1942–1944 гг. действовал и Знаменский женский скит на Караваевых Дачах. В 1944 г. в Киевском Ионинском во имя Святой Троицы мужском монастыре был 31 насельник (29 монахов и два послушника). 12 мая 1944 г. постановлением СНК УССР предписывалось Киевский Ионинский во имя Святой Троицы мужской монастырь закрыть, и его территорию передать для устроения ботанического сада при Институте ботаники Академии Наук УССР (организован в 1935 г. на бывших монастырских землях). Архимандрит Иадор стремился обжаловать данное решение властей и затягивал освобождение братией монастырских помещений. Так, в отчёте благочинному монастырей Киева архимандриту Еразму (Прокопенко) от 18 мая 1944 г. он писал, что ботанический сад уже получил причитавшиеся ему территории. По его словам, в распоряжении Киевского Ионинского во имя Святой Троицы мужского монастыря были храм, восемь домов с 30 кельями, огород и сад площадью 23 га, который к маю был возвращён Институту ботаники. «Нам выделили около половины десятины пахотной земли, так и ту землю ботаники отдали своим рабочим», – сообщал архимандрит Иадор (Центральный государственный архив гражданских объединений Украины). В августе 1944 г. благочинный иеромонах Галактион и иеромонах Димитриан (Васянович; ум. в 1970 г.) подали на имя председателя СНК УССР Никиты Сергеевича Хрущёва заявление об оставлении в их распоряжении монастырских зданий (Центральный государственный архив гражданских объединений Украины). Ожидая положительного ответа, монахи отказывались покидать территорию обители.