В историографии давно обсуждается вопрос о колониальных проектах Гаспара де Колиньи: он поддерживал создание французских колоний в Новом Свете – на территории современной Бразилии, а также во Флориде. Французские колонии могли служить убежищем для протестантов, притесняемых в Западной Европе, а затем стать государством, где гугеноты доминировали бы в силу их числа и богатства и установили бы кальвинистский порядок. В честь Гаспара де Колиньи  остров (в настоящее время остров Вильганьон) в бухте Гуанабара (Рио-де-Жанейро), где находилась первая французская колония, а также построенный там форт были названы его именем. Французская колония «Антарктическая Франция» существовала с 1555 по 1560 гг. и пала под натиском португальцев. Её недолгое существование было омрачено конфликтом католиков и протестантов, который иногда рассматривается исследователями как «пролог» религиозных войн во Франции. Глава колонии Никола Дюран де Вильганьон сначала проявлял симпатии к протестантам и даже приглашал их на остров, но затем вернулся в католическую веру и изгнал из колонии оказавшихся в оппозиции гугенотов (трое из них были показательно казнены и впоследствии стали почитаться как протестантские мученики). Экспедицию с целью основать постоянное поселение на американских землях снаряжали с ведома и при прямой поддержке французского короля. В протестантской историографии участие Гаспара де Колиньи в подготовке этой экспедиции часто приводилось как доказательство его перехода в кальвинизм. Однако современные исследователи отмечают, что в 1555 г. Гаспар де Колиньи ещё не примкнул к протестантизму. Создание «Антарктической Франции» изначально не предполагало миссионерской деятельности среди индейцев. Когда Вильганьон, ещё симпатизировавший протестантизму, обратился к Жану Кальвину, он просил у того пасторов не для проповеднической деятельности, а для «себя и своих людей». В дальнейшем изгнанные из колонии гугеноты не вели планомерной миссионерской работы среди индейцев, а лишь рассказывали им «при случае» о христианском Боге. Колония во Флориде имела, по мнению Гаспара де Колиньи, стратегическое значение: оттуда можно было контролировать часть торговых путей Испании. В 1562–1564 гг. гугеноты Жан Рибо и Рене де Гулен де Лодоньер, наладив дружеские отношения с местными индейскими племенами, основали во Флориде укреплённые форты Шарльфор и Каролина (названы в честь короля Карла IX). В 1565 г. французскую колонию захватили испанцы под командованием Педро Менендеса де Авилеса (они убили всех колонистов). В 1567–1568 гг. против испанцев была снаряжена экспедиция во главе с гасконцем Домиником де Гургом, который, прибыв во Флориду, напал на испанский гарнизон, многих убил, а взятых в плен повесил. Летом 1571 г. при участии Гаспара де Колиньи была подготовлена небольшая эскадра, предназначенная для нападения на испанские колонии; участники экспедиции занялись грабежами и в итоге были убиты. Гаспар де Колиньи сыграл важную роль в переговорах с Жанной д’Альбре, королевой Наварры, ревностной кальвинисткой, о браке её сына короля Генриха Наваррского, предводителя французских гугенотов, с сестрой короля католичкой Маргаритой Валуа.