Ситуация вокруг Киевского во имя святых Флора и Лавра женского монастыря усложнилась после заключения Брестской унии (1596 г.) и особенно после кончины князя Константина Острожского (1608 г.), когда администрацию Киевского замка стали возглавлять преимущественно католики. В это время церковный раскол коснулся и семьи владельцев монастыря. Один из внуков Иакова Гулькевича, бобруйский протоиерей Фёдор, присутствовал на Соборе духовенства в Новогрудке (январь 1596 г.) среди сторонников унии, а другой постригся в монахи с именем Иоанн в Киево-Печерской обители. В первой половине ХVII в. исследователи фиксируют дарения или перевод монастырей, состоявших в семейном владении, под протекторат печерского архимандрита с целью удержать их в лоне православной церкви. В 1642 г. потомок Иакова Гулькевича монах Иоанн дарственной записью на имя игуменьи Агафии (Гуменицкой) и сестёр Киевского во имя святых Флора и Лавра женского монастыря отказался в пользу обители от своих прав с условием «однак при вере старожитний, греческой православнии церкве всходное» оставаться, и, как уточнялось в подтвердительной грамоте 1646 г., «законницы регулы святаго Василия вызнаня веры греческой» после смены патрона находились под «протекциею и урядом духовным велебного в Господе Бозе Архимандрита Печерского теперешняго (Петра (Могилы) и за часом будучого». Бывший владелец отказался от своих прав на монастырь, но вместе с тем обещал ему в случае любого посягательства защиту в судах собственными средствами и, более того, закрепил это обязательство за своими родственниками, гарантией чему стал крупный денежный залог (1 тыс. литовских коп). Трудами игуменьи Агафии монастырь был благоустроен, его территория расширена за счёт покупки и пожертвований соседних участков. Киевский судья Фёдор Гуменицкий, родной брат игуменьи Агафии, передал насельницам право пользоваться доходами от своих имений в сёлах Вишенки, Великие и Малые Дмитровичи, которые вскоре оказались в полном распоряжении монастыря. Царские грамоты и гетманские универсалы подтверждают, что во владении Киевского во имя святых Флора и Лавра женского монастыря со второй половины ХVII в. находились также сёла Яблонька, Сеньковка, Старица. Одновременно в пользу Киевского во имя святых Флора и Лавра женского монастыря сложились и политические условия. Находившийся рядом с обителью Николаевский костёл (с 1640 г. – каменный, тогда как ансамбль Киевского во имя святых Флора и Лавра женского монастыря оставался деревянным) в ходе войны под предводительством Богдана Михайловича Хмельницкого (1648–1654 гг.) пришёл в запустение, а в конце ХVII в. на месте бывшего доминиканского кляштора основали православный мужской монастырь во имя апостолов Петра и Павла (не сохранился). В 1711 г. в Нижний город (на Подол и Плоское), в киевские Флоровский и Иорданский во имя св. Николая Чудотворца монастыри, с Печерского местечка и Верхнего города были переведены монахини двух женских обителей – Печерского Вознесенского и киевского Златоверхого во имя архангела Михаила монастыря, находившихся в подчинении Киево-Печерскому монастырю (Институт рукописей Национальной библиотеки Украины имен В.И. Вернадского). Лаврская земля, на которой остались каменные церкви и другие капитальные строения Вознесенской обители, отошла военному ведомству в период Северной войны (1700–1721 гг.) в связи с планами возведения Печерской крепости (заложена императором Петром I в 1706 г.).