21 мая 1596 г., несмотря на многочисленные протесты православной шляхты, Кобринский монастырь был отдан королём Сигизмундом III Вазой в пожизненное владение униатскому епископу Кириллу (Терлецкому). После заключения Брестской унии 1596 г. Кобринский монастырь официально стал униатским, православная братия была изгнана, а в монастырских постройках разместилась община базилиан. 3 июля 1621 г. возный Брестского воеводства Ждан Лясковский представил в суд заявление. Он отмечал, что в присутствии двух шляхтичей, Григория Славенского и Ивана Лесковского, по требованию священника сгоревшей церкви Кобринского монастыря он, возный, был 20 мая 1621 г. на месте пожара. Вместо церкви, корпусов и хозяйственных зданий Ждан Лясковский увидел пепелище, о чём и свидетельствовал. Во время пожара «до основания сгорела и церковь со звонницей» – древний храм, при котором была основана обитель. Вскоре Кобринский монастырь был восстановлен. В 1626 г. в обители проходил Собор униатских епископов, который начал латинизацию униатской церкви. Собор был созван униатским митрополитом Иосифом Рутским и королём Сигизмундом III Вазой. Однако неприятие этой идеи православной иерархией и Римской курией сделали невозможным примирение обеих сторон. В сентябре 1626 г. в Кобринском монастыре также проходило собрание греко-католического клира под председательством митрополита Иосифа Рутского. Около 1643–1644 гг. от униатов Кобринского монастыря пострадала братия православного брестского во имя преподобного Симеона Столпника монастыря. Настоятель Афанасий (Филиппович) направил своих иноков в Купятицкий в честь Введения во храм Пресвятой Богородицы монастырь. Но по дороге в Кобрин сторонники униатского архимандрита Павла Овлочинского схватили монахов, отняли у них коней и всё имущество, поиздевались над священником и дьяконом. В 1652 г. польский король Ян II Казимир Ваза, «зная ревность и усердие к унии монаха Ордена св. Василия Венедикта Глинского», предоставил ему Кобринскую архимандритию с согласия Пахомия Войно-Оранского, епископа Пинского, коадъютора Киевской митрополии и кобринского архимандрита. Венедикт Глинский получил полное право пользоваться данной ему архимандритией с церковью, монастырём, фольварками, сёлами, землями, полями, лесами, сенокосами, озёрами, реками, прудами, мельницами и другими доходами. Подтверждая пожалование в 1669 г., польский король Михаил Корибут Вишневецкий указал, что передаёт также Венедикту Глинскому «небольшую мельницу под Кобрином, над рекой Мухавцем, в так называемом урочище Лисовское, с правом ловить рыбу в Мухавце, но так, чтобы церковный невод ходил после замкового, и кроме того предоставляет ему право пользоваться десятою меркою с Кобринских мельниц».