Поводом к новому военному столкновению стала смерть миланского герцога Франческо II Сфорца (1535 г.). Карл V захватил Милан и объявил Ломбардию владением Испании. Франциск I предъявил претензии на Савойю (его мать, Луиза Савойская, была старшей сводной сестрой герцога) и захватил её и большую часть Пьемонта с Турином. Карл V вторгся в Прованс и дошёл до Экс-ан-Прованса, но решил не осаждать хорошо укреплённый Авиньон, а вернуться в Испанию. В конце 1536 г. по негласному договору с французами турецкий флот встал в Марселе, угрожая Генуе. В 1537 г. командующий турецким флотом пират Хайр-ад-Дин (Хайруддин) Барбаросса совершил ряд набегов на итальянское побережье и осадил Корфу (Керкиру). Карлу V пришлось начать мирные переговоры, 18 июня 1538 г. было заключено Ниццкое перемирие, по условиям которого Франция удержала за собой Савойю и значительную часть Пьемонта. В 1538–1540 гг. Карл V участвовал в войне Священной лиги против турок, в октябре 1541 г. пытался овладеть Алжиром, крупной турецкой базой в Западном Средиземноморье. В следующей Итальянской войне (1542–1544 гг.) Франция выступила в союзе с Османской империей. В 1543 г. турецкий флот под командованием Хайр-ад-Дина Барбароссы, соединившись под Марселем с французскими кораблями, осадил имперский город Ниццу. В Пьемонте после первоначальных успехов войска Карла V были разбиты французами в битве при Черезоле (11 апреля 1544 г.). Несмотря на победы, союз с турками осложнил отношения французского монарха с европейскими христианскими правителями. Карлу V удалось подтвердить договор с английским королём Генрихом VIII. Вторжение английской армии во Францию вынудило Франциска I вывести значительную часть войска из Пьемонта. Англичане высадились в Северной Франции и захватили Булонь, а армия Карла V, заняв Суасон, начала наступление на Париж. Однако разногласия с Генрихом VIII, антииспанские восстания в Генуе и Сиене, атаки турецкого флота, а также ухудшение политической ситуации на германских землях заставили Карла V пойти на переговоры с Франциском I. По заключённому в Крепи мирному договору (18 сентября 1544 г.) император отказался от претензии на Бургундию, а французский король – от претензии на Неаполитанское королевство, был подтверждён сюзеренитет Франциска I над Фландрией и Артуа. Кроме того, Франциск I обещал оказать императору помощь в борьбе с турками, а согласно секретному приложению, должен был способствовать созыву вселенского Собора и искоренению протестантизма, в том числе, при необходимости, с применением силы. После смерти Франциска I в 1547 г. на французский престол взошёл его сын Генрих II, который продолжил антигабсбургскую политику отца. Ему удалось в 1548 г. присоединить к Франции маркизат Салуццо в Пьемонте и сблизиться с папой Римским Павлом III, недовольным позицией императора на Тридентском соборе. Однако новый папа Римский Юлий III, заинтересованный в возвращении в состав папских владений Пармы с прилегающей областью, которые были выделены его предшественником Павлом III в герцогство для незаконнорожденного сына Пьетро Луиджи Фарнезе, сначала выступал на стороне императора.