В июле 1522 г. англичане из остававшегося под их властью Кале атаковали французские Бретань и Пикардию, а Карл V вторгся в Южную Францию через Пиренеи. В сентябре 1523 г. английская армия под командованием Чарлза Брандона, герцога Саффолка, из Кале дошла почти до Парижа, но, не дождавшись действий императорского войска, отступила. В феврале 1524 г. Карл V отбил у французов город Фуэнтеррабия. Франциску I удалось собрать новую армию, и в октябре 1524 г. она перешла через Альпы и двинулась к Милану. 24 февраля 1525 г. французы были разбиты Карлом V в битве при Павии и король попал в плен. В плену, в Мадриде, Франциску I пришлось подписать мирный договор (январь 1526 г.): французский король отказывался от претензий на итальянские владения и от прав на Бургундию, а также обещал оказывать императору помощь в борьбе с протестантами (Мадридский договор не был ратифицирован во Франции). В марте 1526 г. Франциск I был освобождён из плена и приступил к созданию антигабсбургской коалиции. Образованную в том же году Коньякскую лигу, в которую помимо Франции вошли Венеция, Генуя, Флоренция и Милан, поддержал папа Римский Климент VII. Итальянские члены лиги начали военные действия против императора, стремясь изгнать его из Милана. 6-8 мая 1527 г. немецкие наёмники на службе у императора самовольно захватили и разграбили Рим. Папа спасся, укрывшись в замке Святого ангела. На сближение с Карлом V он пошёл только после поражения в августе 1528 г. французов, осаждавших Неаполь. Договоры, заключённые в 1529 г., подвели итоги войны с Коньякской лигой: Франциск I отказался от притязаний на Италию, сохранив только Пьемонт, и на Фландрию и Артуа, фактически принадлежавшие Карлу V, и обещал императору помощь в борьбе с турками, итальянские государства утратили возможность вести самостоятельную политику в борьбе между Францией и Священной Римской империей – Генуя вошла в зону габсбургского влияния, Венеция перешла к политике нейтралитета. Результатом войны стала и императорская коронация Карла V. В 1530 гг. значительную роль стали играть новые факторы, ослаблявшие позиции Карла V в противостоянии с французским королём: в Германии оформился протестантский Шмалькальденский союз, а Франциск I вёл переговоры о создании антигабсбургского военного союза как с турецким султаном Сулейманом I Великолепным, желавшим ослабления власти императора для захвата турками Венгрии, так и с немецкими князьями (например, он способствовал браку герцога Вильгельма Юлих-Клевского, конфликтовавшего с Карлом V из-за герцогства Гелдерн, на своей 13-летней племяннице Иоанне (см. Жанна д`Альбре), впоследствии брак был аннулирован).