В Острог были приглашены книжники, учившиеся в европейских и восточных высших учебных заведениях: Киприан Острожский, получивший образование в Венеции и Падуе, ученик Мелетия I (Пигаса) Исаакий (Борискович), учившийся в римской Греческой коллегии Эммануил Ахиллеос. Накануне Брестского Собора 1596 г. в Острог приехал для «отправовання наук освобожденных» Никифор (Парасхес-Кантакузин), написавший здесь несохранившиеся публицистические произведения. Острог посещали митрополит Пелагонийский Иеремия, епископ Стагонский Авраамий Гацид, архимандрит, впоследствии Иерусалимский патриарх, Феофан IV. Охридский архиепископ Афанасий привёз в Острог регалии византийских императоров. С Острожской академией сотрудничали польские деятели. Среди них – астроном, математик, доктор медицины, выпускник Краковской академии и Падуанского университета католик Ян Лятош (1539–1608 гг.), который за критику григорианской календарной реформы был вынужден оставить преподавание в Кракове. Последние десять лет жизни он провёл в Остроге, составляя сочинения, направленные против григорианского календаря (публиковал в Вильно). Исследователи предполагают, что в деятельности Острожской академии мог участвовать латиноязычный поэт, выпускник Краковской академии Симон Пекалид. Авторитет Острожской академии усилился благодаря деятельности полемиста-протестанта (член общества чешских братьев) польского шляхтича Мартина Броневского, которого князь К.К. Острожский пригласил в Острог для полемики с униатами и католиками. Сочинение Мартина Броневского, писавшего под псевдонимом Христофор Филалет («Апокрисис») вышло в Остроге в 1598–1599 гг. Протестант Мотовило составил ответ на трактат Петра Скарги «О единстве Церкви Божией под одним пастырем и об отступлении греков от этого единства» (ответ не сохранился, упоминается в двух письмах князя А.М. Курбского князю К.К. Острожскому). Славу Острожскому центру принесли украинские писатели и полемисты, богословы-самоучки Герасим Смотрицкий, Иоанн (Вишенский), Василий Суражский, Клирик Острожский, протопоп Игнатий (И.З. Мицко отождествляет его с Клириком Острожским), священник Дамиан Наливайко и др. Основным содержанием их произведений, изданных преимущественно в Остроге, была борьба против унии и католического прозелитизма. Герасим Смотрицкий написал труды «Ключ Царства небесного» и «Календарь римский новый» (изданы в Остроге в 1587 г. одной книгой). Управитель имений Острожской академии Василий Суражский в полемической «Книжице о единой истинной православной вере» («Книжица в шести главах», 1588 г.) вёл дискуссию с Петром Скаргой и Бенедиктом Гербестом, а также с протестантами. В Остроге подготовлено анонимное сочинение «Ектезис...» («Ekthesis...»), изданное в 1597 г. в Кракове, направленное против Брестского униатского Собора в защиту Брестского Собора православных, содержит ряд решений последнего. В 1598 г. Острожская типография издала антиуниатскую «Книжицу в десяти разделах», в которую вошли изложение православной веры, многочисленные послания патриарха Мелетия Пигаса, в том числе с критикой григорианского календаря, Брестской унии, произведение Иоанна (Вишенского), другие сочинения. Сборник сыграл большую роль в борьбе против католицизма и унии.