В документе о разделе владений князя К.К. Острожского 1603 г. указано точное расположение Острожской академии.: «В пригородку конюшня с [расположенным] при ней двором. Типография и школа должны быть совместно...». В связи с тем, что сыновья князя К.К. Острожского поделили «пригородок» пополам, школа и типография должны были находиться под опекой владельцев обеих половин нижнего замка. И.А. Тесленко установил, что Острожская академия располагалась возле «Боровицкого плаца» (владение в нижнем замке), который принадлежал Александру Стажицкому, одному из слуг рода Острожских. До Стажицких участок принадлежал представителям рода Боровицких – наследственных слуг князей (последний из них (острожский староста Ждан Боровицкий) умер, не имея потомков, в 1600 г.). Усадьба Стажицких чётко локализована: «С одной стороны рядом с русской школой, а с другой – круг двора пана Станислава Закшевського». В истории академии исследователи выделяют три этапа. Начальный период (1576–1586 гг.) характеризуется интеллектуальным подъёмом, связанным, прежде всего, с публикацией «Острожской Библии» (1581 г.). Тогда сформировался круг деятелей Острожской академии разных конфессий и национальностей с преобладанием православных, в который входили ректор Острожской школы Герасим Смотрицкий, Иван Фёдоров, Эммануил Мосхопулос (выпускник римской Греческой коллегии), протестанты Андрей Рымша и Мотовило, Дионисий (Ралли-Палеолог), Евстафий Нафанаил. Почти все они участвовали в подготовке «Острожской Библии». Исследователи предполагают, что в Острожский кружок входили также греческий епископ Тимофей, Мегленский епископ Феофан Грек. Помимо Библии в этот период в Острожской типографии были напечатаны «Азбука» ((«Букварь)», 1578 г.; второе издание – «Книга словенская, рекомая Грамматика», 1598 г.), «Книжка, собрание вещей нужнейших» Тимофея Михайловича (Аннича) (1580 г.) – первый в истории кириллического книгопечатания алфавитно-предметный указатель к Новому Завету (большинство сохранившихся экземпляров приплетены к острожскому изданию Нового Завета с Псалтирью (1580 г.)), стихотворная «Хронология» Андрея Рымши, посвящённая событиям земной жизни Иисуса Христа (1581 г.), Псалтирь (1580 г.). Временем наивысшего развития Острожской академии стал период 1587 г. – начало 1620 гг. Основным его содержанием была борьба против попыток заключения унии православной и католической церквей и против Брестской унии 1596 г. После Герасима Смотрицкого ректором школы был некий Максим (упоминается в 1592 г.) (исследователи полагают, что слуга князя К.К. Острожского Мартин Грабкович, посланный в 1595 г. ко Льву Сапеге с целью добиться созыва Собора для заключения унии с Римом). В 1594–1595 и 1596 гг. ректором был Кирилл Лукарис (см. Кирилл I Лукарис), который преподавал в Острожской академии греческий язык (вторично Кирилл Лукарис находился в Остроге в 1600–1601 гг.). В Острожской школе преподавали львовские братчики Юрий Рогатинец и Гаврило Дорофеевич, исследователи полагают, что также будущий Киевский  митрополит Иов (Борецкий), который в начале XVII в. был связан с типографией в Дермани.