Рыцари Мальтийского ордена продолжили морскую войну против турок. В 1531 г. они атаковали Модон на юге Пелопоннеса и затем направили свои галеры на Корфу (Керкиры), Тунис и Алжир. В 1551 г. Триполи был захвачен корсаром Тургут-реисом. Пиратские нападения Мальтийского ордена в Средиземноморье побудили турецкого султана Сулеймана I к новой атаке против рыцарей. В мае 1565 г. многотысячная турецкая армия высадилась на Мальте и начала осаду орденских укреплений. 23 июня ценой больших потерь турки взяли форт святого Эльма. Форты Святого ангела и святого Михаила продолжали отражать все попытки штурма. В начале июля Мальтийский орден получил первое подкрепление из 700 человек. К сентябрю в турецком войске закончились запасы воды и продуктов питания, также изменилась погода – повысилась влажность, что имело плачевные последствия для турецкой артиллерии. 7 сентября на помощь Ордену прибыл испанский флот, который нанёс 11 сентября поражение туркам. На следующий день все турецкие силы покинули Мальту. Командовавший успешной обороной острова магистр Жан Паризо де ла Валетт (1557–1568 гг.) основал на Мальте новую укреплённую столицу (названа в его честь Валеттой). Город застраивали по планам итальянского архитектора Франческо Лапарелли, которому помогал мальтиец Джироламо Кассар. В Валетте были сооружены дворец великих магистров, госпиталь и церковь святого Иоанна. Структуры Ордена и принятые на Родосе принципы управления были перенесены на Мальту. Для жителей острова господство Мальтийского ордена стало временем стабильности и процветания, вместе с тем представителям мальтийской знати было запрещено вступать в Орден, что исключало их участие в управлении Мальтой и вызывало недовольство с их стороны. После отражения турецкой осады флот Мальтийского ордена продолжил пиратские нападения (corso) на турецкие суда. В октябре 1571 г. галеры рыцарей участвовали в разгроме турецкого флота при Лепанто. В 1606 г. рыцари атаковали с моря Хаммамет в Тунисе, в 1611 г. – Коринф. В 1614 г. турки снова высадились на Мальте, но вскоре отступили. В 1619 г. рыцари Мальтийского ордена неудачно атаковали Сус в Тунисе, но рейды 1639–1640 гг. против Триполи и Голетты (ныне Хальк-эль-Уэд, Тунис) были более успешными. Вплоть до середины XVIII в. Мальтийский орден нападал в Средиземном море не только на мусульманские корабли, но и на корабли христиан, заподозренных в торговле с мусульманами, что приносило рыцарям большой доход.