В 1365 г. флот Ордена поддержал Крестовый поход короля Кипра Петра I (1359–1369 гг.) и участвовал в захвате Александрии. В 1374 г. Папский престол передал госпитальерам управление Смирной. Город удерживался Орденом до 1402 г., когда он был захвачен войсками Тамерлана. В 1376 г. Джоанна I, королева Неаполя (1343–1382 гг.), передала на пятилетний срок рыцарям Родоса управление Ахейским княжеством на Пелопоннесе. После падения Смирны Орден в 1407–1408 гг. соорудил на малоазиатском берегу другой форпост – замок святого Петра. В 1440 и 1444 гг. Родос выдержал две осады мамлюков. Однако главную опасность для рыцарей представляли турки-османы, захватившие в 1453 г. Константинополь и уже в 1454 г. атаковавшие острова Додеканес после отказа Ордена платить дань турецкому султану. В 1464 и 1466 гг. госпитальеры снова отказались платить дань туркам. Нападение на Родос казалось неминуемым, но в этот период османы были заняты в других регионах, в основном, на Балканах. Воспользовавшись этим, магистр Ордена Пьер д'Обюссон (1476–1503 гг.), укрепил городские стены и собрал на Западе дополнительные войска для обороны Родоса. Он заключил перемирие с мамлюками и подписал в 1478 г. договор с правителем Туниса о доставке зерна на остров. В конце 1479 г. турецкая армада появилась близ Родоса, в мае 1480 г. началась осада. Несмотря на то, что защитники окружённого города (300 братьев-рыцарей, 300 сержантов и 3-4 тыс. наёмников из Франции и Италии) заметно уступали в численности нападавшим и 27–28 июля 1480 г. турецкое войско прорвалось в город, оно было вынуждено отступить, понеся значительные потери. 17 августа султан Мехмед II (1444–1446, 1451–1481 гг.), завоеватель Константинополя, завершил осаду Родоса, не достигнув цели. Но новая турецкая атака представлялась госпитальерам лишь делом времени. После осады 1480 г. и мощных землетрясений 1481 г. на Родосе были произведены масштабные строительные работы. В 1498 г. Орден возобновил перемирие с османами. В 1516–1517 гг. турки овладели Сирией и Египтом, положив конец господству мамлюков. В июне 1522 г. флот турецкого султана Сулеймана I из 400 кораблей с многотысячной армией на борту появился возле Родоса. Турецкой армаде Орден мог противопоставить войско из 600 братьев, 500 генуэзских моряков, 400 критских наемников и нескольких тысяч греков – жителей города. Тем не менее, госпитальерам вновь удалось успешно отразить штурмы городских стен. С наступлением зимы Сулейман I предложил защитникам почётную капитуляцию, опасаясь возможного подхода подкрепления с Запада. Рыцари сначала ответили отказом, но под давлением местного населения, опасавшегося резни в городе в случае его успешного штурма турками, передумали и 9 декабря 1522 г. решили капитулировать. 20 декабря был заключён договор о почётной сдаче Родоса, а 1 января 1523 г. магистр с братьями Ордена и некоторыми семьями греческих подданных покинули остров. Вскоре туркам сдались замок святого Петра и остров Кос. Госпитальеры направились на Крит, откуда 1 марта 1523 г. прибыли в Мессину. В августе того же года начались переговоры с папой Римским Адрианом VI (1522–1523 гг.) о будущем Ордена. 24 марта 1530 г. император Карл V передал рыцарям острова Мальту и Гоцо вместе с завоёванным испанцами в 1510 г. Триполи. 26 октября 1530 г. магистр Филипп де Вилье де л'Иль-Адам (1521–1534 гг.) прибыл на Мальту.