Димитриев монастырь пострадал в Смутное время. В «Росписи русского войска, посланного против самозванца» 1604 г., упомянуты «Спасского монастыря, что на Прилуке, девять человек конных (да шесть лошадей, а за ними для береженья и корму один человек)». На снаряжение армии Михаила Васильевича Скопина-Шуйского в 1610 г. Димитриев монастырь передал 50 руб., затем ещё 300 руб. и 60 серебряных сосудов. В период борьбы с интервентами в 1612 г. монастырь кормил стрельцов и казаков, снаряжал отряды ратников в ополчение. В октябре 1612 г. Димитриев монастырь был разорён польско-литовскими отрядами, в 1613/1614 г. – отрядами сибирского царевича Араслана Алеевича с татарами и казаками, которые были посланы для охраны Вологды. 18 декабря 1619 г. в трапезной палате Димитриева монастыря погибли 200 чел., в том числе 59 монахов, были сожжены трапеза и службы, угнан монастырский скот. В день гибели братии в обители ежегодно совершались заупокойное богослужение и поминальная трапеза. Имена погибших были записаны в синодик. Однако историки ставят под сомнение это разорение и предполагают, что дважды описанное в летописи нападение на монастырь 18 декабря относится к 1612 г., а не к 1619 г. В 1619 г. игумен Кирилл II (1613–1623 гг.) вместе с архиепископом Рязанским и Муромским Иосифом, князем Дмитрием Михайловичем Пожарским и окольничим князем Волконским встречал близ Можайска возвращавшегося из плена митрополита Филарета (Романова; впоследствии патриарх Московский). В 1724 г. к Димитриеву монастырю было приписано пять обителей: Григориев Пельшемский Лопотов монастырь, Заоникиева Владимирская, Белавинская Богоявленская, Арсениева-на-Масляне и Репная Спасская пустыни, в 1726 г. – Аресениев Комельский, вологодский в честь Сошествия Святого Духа на апостолов, Печенгский в честь Преображения Господня монастыри, Рябинина Казанская и Александрова Коровина Троицкая пустыни. По штатам 1764 г., Димитриев монастырь был причислен ко второму классу; в степени вологодских монастырей он был первым, среди русских 2-классных обителей – двадцатым. Во время Отечественной войны 1812 г. ректор Московской духовной академии архимандрит Симон и протоиерей московского Архангельского собора Алексий Шумилин привезли в Димитриев монастырь ценности Патриаршей ризницы, Троице-Сергиевой лавры, московских Чудова, Новоспасского, Знаменского, Новодевичьего, Покровского, Угрешского, Вознесенского монастырей и некоторых соборов столицы. Реликвии хранились в Спасском соборе. В 1824 г. Димитриев монастырь посетил император Александр I. По воспоминаниям преподобного Пимена (Мясникова), состояние Димитриева монастыря в середине XIX в. производило «весьма грустное впечатление» и свидетельствовало о «...прошлом благоустройстве, благолепии и величии обители». До первой трети XVI в. все постройки в монастыре были деревянными. Летописный свод 1497 г. и Вологодская летопись, написанные, вероятно, в Димитриевом монастыре, содержат сведения о частых пожарах в обители и монастырских вотчинах. Каменное строительство началось в 1530 гг. – возобновилась храмоздательная деятельность в тех монастырях Белозерья, Вологды, Костромской десятины, которые посетил великий князь Василий III Иоаннович в 1528 г.