Вскоре, согласно «Житию», на Димитриев монастырь напали «вятчане», возможно, союзники звенигородского князя Василия Юрьевича Косого. Сведения по ранней истории Димитриева монастыря отрывочны и скупы. С 1462 г. он находился на территории Вологодского удельного княжества. Сын великого князя Василия II Васильевича, князь Андрей Васильевич Меньшой, в грамоте 1471/1472 г., выданной игумену Макарию, называет монастырь «своим» и упоминает грамоты великого князя Василия II и великой княгини Марии Ярославны. Однако в XV – первой половине XVI в. Димитриев монастырь не был связан с великокняжеским домом, из его членов лишь князь Иван Борисович Рузский дал вклад в монастырь 5 руб. Князь Андрей Васильевич не завещал монастырю ничего, правда, грамотой 1474/1475 г. заменил дань с вологодских владений монастыря оброком (5 р.). В XVI в. значение Димитриева монастыря в церковной жизни Вологодской епархии и Русского Севера возросло. Так, настоятелю монастыря игумену Мисаилу (Панкратьеву; 1510–1538 гг.) «было поручено епископами великопермскими управление вологодским духовенством». По благословению игумена Мисаила была возобновлена после разорения гробница преподобных Григория и Кассиана Авнежских и часовня над ней. В декабре 1528 г. Димитриев монастырь посетили великий князь Василий III Иванович и великая княгиня Елена Васильевна Глинская, и «милостыню велию давал и потешение братии». В послании старцам Кириллова Белозерского монастыря царь Иван IV Васильевич Грозный упоминал Димитриев монастырь в ряду авторитетных монастырей, которые «благочестием стоят и неоскудны бывают». В 1533/1534 – 1578/1579 гг. он выдал Димитриеву монастырю 16 жалованных и льготных грамот. Для поминовения в монастыре царь прислал «синодик опальных князей и бояр» (сохранился в составе монастырского синодика (список 1745 г.) в Вологодском музее-заповеднике). В июне 1542 г. митрополит Московский Макарий прислал в Димитриев монастырь Уставную грамоту (подтверждена в марте 1564 г. митрополитом Афанасием, в 1567 г. епископом Пермским и Вологодским Иоасафом) о том, что игумен и клир пяти церквей в монастырских сёлах «не тянут никакие подати». Монастырские описи 1654 и 1656 гг. упоминают и «благословенную грамоту о церковном поставлении и церковной дани», данную в 1542/1543 г. святителем Макарием Московским. Возможно, Димитриев монастырь был первым близ Вологды монастырём, вошедшим в Митрополичью область; видимо, с 1567 г. стал епархиальным. В XVI в. Димитриев монастырь был степенным, среди вологодских обителей занимал второе место после Спасо-Каменного монастыря. В акте Собора 1580 г. о землевладении игумен Димитриева монастыря стоит 28-м среди настоятелей 35 крупных монастырей; в «Лествице» патриарха Иоасафа I 1635–1637 гг. – 35-м среди 46 настоятелей главных монастырей; по Соборному уложению 1649 г. – 37-м среди 49 настоятелей. В управление игуменов Димитриева монастыря перешли не позднее 1534–1544 гг. «монастырёк» в честь Воскресения Господня, основанный преподобным Димитрием на реке Великой в Авнежской волости, и не позднее 1551 г. – Глубокоозёрская Преображенская пустынь.