Предметом особого внимания Леонардо да Винчи стало выражение душевных движений через мимическую характеристику и жест: в образах апостолов он попытался отразить весь спектр человеческих эмоций, вызванных вестью о скором предательстве Христа одним из учеников. Леонардо да Винчи выбрал для изображения момент максимальной напряжённости: мгновение между тем, как прозвучали слова о предателе, и определением его имени. Исследователи отмечают, что трактовка темы Тайной вечери у Леонардо да Винчи отличается от традиции её изображения во флорентийских монастырских трапезных, где фигура Иуды помещена за столом напротив остальных участников сцены и таким образом противопоставлена им (например, у Андреа дель Кастаньо или Доменико Гирландайо), и от ломбардского варианта её интерпретации (Христос протягивает Иуде хлеб). Рисунки Леонардо да Винчи (Королевская библиотека, Виндзор; Галерея Академии, Венеция) свидетельствуют о том, что он внимательно изучил обе традиции. Центральной темой росписи у Леонардо да Винчи остаётся установление таинства евхаристии. По мнению Микеланджело Росси, необычное иконографическое решение могло быть подсказано Леонардо да Винчи приором монастыря Санта-Мария-делле-Грацие, учёным доминиканцем Винченцо Банделло, и основываться на томистском истолковании сюжета Тайной вечери. В композиции подчёркивается евхаристическое и священническое значение фигуры Христа, потому общая схема Его изображения у Леонардо да Винчи перекликается с иконографией Imago Pietatis и Traditio Legis. В то же время исследователи отмечают, что фреска не лишена деталей, вносящих в неё элемент живой повествовательности; к их числу исследователи относят натуралистически написанный натюрморт на столе. После захвата Милана войсками французского короля Людовика XII Леонардо да Винчи в 1499 г. покинул город. По пути во Флоренцию, куда он прибыл в апреле 1500 г., ненадолго останавливался в Мантуе, где рисовал Изабеллу д'Эсте: этот лист (Лувр, Париж), как полагают исследователи, должен был служить подготовительным рисунком к живописному портрету маркизы. В 2013 г. в Швейцарии (частное собрание Эмидии Чеккини) был обнаружен созданный на его основе портрет маслом, представляющий маркизу Мантуи в образе святой Екатерины. На основании технико-технологической экспертизы он может быть приписан Леонардо да Винчи или, во всяком случае, датирован началом XVI в. Помимо собственного портрета кисти Леонардо да Винчи Изабелла д'Эсте очень хотела получить в коллекцию другие работы художника. Следующие шесть лет маркиза вела с ним переписку, упрашивая мастера «написать юного Христа, в возрасте около 12 лет, когда он беседовал с учителями в Иерусалимском храме, и выполнить эту работу с той сладостностью и нежным и изысканным очарованием, которым отличается особое совершенство <его> искусства».