В Милане у Леонардо да Винчи была возможность общаться с гуманистами и учёными, занимавшимися математикой, медициной и естественными науками: Джорджо Валлой, Пьетро Монти, изучать рукописи медика, математика и философа Джованни Марлиани. Около 1496 г. Леонардо да Винчи познакомился с выдающимся математиком Лукой Пачоли, помогал ему иллюстрировать трактат «О божественной пропорции» (Pacioli L. «De Divina Proportione». Venetiis, 1509 г.); этим фактом обусловлены новый виток увлечения Леонардо да Винчи проблемами оптики и перспективы и применение им законов геометрии при изображении природы. Здесь же Леонардо да Винчи начал вести «записные книжки» – заметки, написанные зеркальным письмом и сопровождаемые многочисленными иллюстративными зарисовками. Скорее всего, в Милане Леонардо да Винчи впервые увлёкся идеей воздухоплавания и стал размышлять о конструировании летательных аппаратов. Как архитектор и инженер герцога Леонардо да Винчи занимался оформлением придворных празднеств, в частности, «Праздника рая», сочинённого Бернардо Беллинчони и устроенного в честь Изабеллы Арагонской, супруги герцога Джан Галеаццо Марии Сфорцы (1490 г.), и рыцарских турниров (джостр, или каруселей), приуроченных к свадьбе Лодовико Моро и Беатриче д'Эсте (1491 г.). Главными достижениями Леонардо да Винчи этого периода исследователи называют его живописные произведения. Среди них «Портрет музыканта» (около 1485 г., не окончен; Амброзианская пинакотека, Милан), в котором острота психологической характеристики оттеняется мягкими колористическими эффектами. По разным версиям, на нём изображены известный композитор франко-фламандской школы Жоскен Депре или молодой музыкант – друг Леонардо да Винчи Аталанте Мильоротти. Два других портрета Леонардо да Винчи, выполненные в тот же период, оказали прямое влияние на последователей художника. Исследователи отмечают, что в них простота композиции способна вызвать в памяти портретные бюсты работы Верроккьо, а гармоничность линейного ритма сочетается с вниманием к деталям и разнообразию фактур («Дама с горностаем» (1489–1490 гг., Краков, собрание князей Чарторыйских); «Прекрасная Ферроньера» (1490–1495 гг., Лувр, Париж; принадлежала королю Франции Франциску I)). В 1483 г. совместно с братьями Эванджелистой и Джованни Амброджо де Предис Леонардо да Винчи заключил договор на исполнение центральной и двух боковых створок полиптиха для капеллы Непорочного Зачатия церкви Сан-Франческо-Гранде в Милане. Итогом этой работы стали две версии картины «Мадонна в скалах» (Лувр, Париж; Национальная галерея, Лондон). Более ранней принято считать парижскую версию, которая в начале XVI в. была вывезена во Францию. В сложной иконографической программе картины отчётливо проведена тема Непорочного Зачатия (грот является аллюзией на девство Марии, см.: Песн. 2:14) и подчёркнута пророческая роль Иоанна Крестителя: именно на него указывает сидящий слева от Мадонны архангел Уриил, и его благословляет Младенец Христос. Благодаря суровому, могучему скальному пейзажу, внутри которого помещена сцена, она приобретает вселенский, внеисторический масштаб.