В Переславле-Залесском начал работу над новой темой научных исследований – диагностика и терапия гнойных заболеваний. Из-за болезни жены (туберкулёз) подал заявку на должность главного врача Ташкентской городской больницы, надеясь, что среднеазиатский климат облегчит течение болезни. В марте 1917 г. переехал с семьёй в Ташкент, где работал в тяжелейших условиях революционного периода и гражданской войны. В начале 1919 г. был арестован по доносу о причастности к антибольшевистскому восстанию в Ташкенте, чудом избежал внесудебной расправы благодаря заступничеству одного из бывших пациентов. Вскоре был освобождён и немедленно вернулся к врачебной практике. Совмещал напряжённую работу с научной и педагогической деятельностью. Преподавал в Ташкентской медицинской школе. Был одним из инициаторов создания в 1920 г. Ташкентского университета, где стал профессором, заведующим кафедрой топографической анатомии и оперативной хирургии медицинского факультета. Был председателем Союза врачей Туркестана (с 1917 г.), одним из организаторов первого научного съезда врачей Туркестана (1922 г.), на котором выступил с четырьмя докладами. В Ташкенте активно работал над своим главным научным трудом по гнойной хирургии, разрабатывал методы хирургического лечения глазных заболеваний. Несмотря на враждебное отношение советской власти к религии, В.Ф. Войно-Ясенецкий не скрывал своей веры. Перед каждой операцией осенял себя крестным знамением и молился перед висевшей в операционной иконой Божьей Матери. Стал одним из организаторов Туркестанского религиозно-просветительского братства; 4 июля 1918 г. выступил с докладом о его учреждении на втором Туркестанском съезде духовенства и мирян. Проводил беседы на духовные темы в ташкентских храмах. В ноябре 1919 г. овдовел, оставшись с четырьмя детьми, заботу о которых взяла на себя операционная сестра София Сергеевна Велецкая. В конце 1920 г., после доклада на епархиальном собрании о положении дел в Туркестанской епархии, имел беседу с Туркестанским и Ташкентским архиепископом Иннокентием (Пустынским), который предложил ему стать священником. Хотя раньше профессор В.Ф. Войно-Ясенецкий не думал о священстве, слова архиерея он принял как Божий призыв и, ни минуты не размышляя, ответил: «Хорошо, владыка! Буду священником, если это угодно Богу!» 8 февраля 1921 г. был рукоположён архиепископом Иннокентием (Пустынским) во диакона, а 15 февраля, в праздник Сретения Господня, – во иерея. Был определён к ташкентскому собору Сергия Радонежского. Архиепископ Иннокентий (Пустынский), который сам проповедовал редко, назначил иерея В.Ф. Войно-Ясенецкого четвёртым священником кафедрального собора и поручил ему проповедовать, приведя слова апостола Павла: «Ваше дело не крестити, а благовестити» (1 Кор. 1:17; обычные требы он исполнял крайне редко). Участвовал в публичных диспутах с антирелигиозными пропагандистами. Продолжал работать главным хирургом в первой ташкентской городской больнице. Читал лекции в университете в рясе, со священническим крестом на груди. Летом 1921 г. был вызван в качестве эксперта на открытый судебный процесс над ташкентскими врачами во главе с профессором Петром Порфирьевичем Ситковским.