В мае 1921 г. викарий Киевской епархии, епископ Звенигородский Алексий (Готовцев) был назначен настоятелем обители, помещения которой почти полностью занимали советские учреждения. С 1922 г. в кельях начали размещать студенческие общежития, трапезную использовали как студенческую столовую. В апреле 1922 г. епископ Алексий (Готовцев) был арестован. 21–23 мая Киевский ревтрибунал приговорил епископа Алексия (Готовцева), наместника архимандрита Тихона, ризничего архимандрита Иннокентия к пяти годам принудительных работ, заменённых домашним заключением. В ночь на 4 апреля 1923 г. епископ Алексий (Готовцев) вновь был арестован и выслан в Москву. 14 мая 1922 г. началось изъятие церковных ценностей из обители. Местонахождение многих святынь обители, в том числе раки великомученицы Варвары и серебряных врат иконостаса, исследователям неизвестно. Монастырское книжное собрание оказалось во Всенародной библиотеке Украины при ВУАН (ныне Национальная библиотека Украины имени Владимира Ивановича Вернадского). Некоторое время Михайловский собор занимала община раскольнической «Деятельно-Христовой Церкви», которую возглавлял «епископ» Пётр Тарнавский, совершавший в Михайловском соборе «хиротонии», в 1930 г. – община Украинской автокефальной православной церкви (УАПЦ). 24 января 1934 г. XII съезд Коммунистической партии Украины и Всеукраинский ЦИК приняли решение о перенесении столицы из Харькова в Киев. На месте Киевского Златоверхого монастыря планировалось построить Правительственный центр. Против уничтожения обители выступили киевские и московские учёные. Летом 1934 г. перед уничтожением Михайловского собора сотрудники Института материальной культуры УАН всего лишь за месяц произвели его обследование и вынуждены были принять решение, что храм как позднейшая барочная постройка не представляет исторической ценности. Весной 1935 г. с собора сняли купола, а 14 августа 1937 г. его взорвали. В 1941 г. Киевский Златоверхий монастырь был возрождён; под началом наместника архимандрита Еразма (Довбенко) в обители проживало 18 насельников. С конца декабря 1941 г. в Иоанно-Богословской церкви совершал архиерейские богослужения епископ Пантелеимон (Рудык), временно управлявший Киевской епархией. После освобождения Киева от фашистских захватчиков в 1945 г. в обители предполагалось открытие пастырско-богословских курсов. 8 февраля 1947 г. помещение монастырской трапезной было предоставлено Киевской духовной семинарии. Но в 1949 г. монастырь был закрыт, келейный корпус передан организации «Заготзерно», в трапезной Иоанно-Богословской церкви разместился спортзал. В 1963 г. здание Иоанно-Богословской церкви получило статус архитектурного памятника УССР, в 1976–1981 гг. реставрировалось. В 1991 г. храм был передан в пользование общине неканонической УАПЦ. С 1998 г. по указу Президента Украины (1996 г.) корпорация «Укрреставрация» воссоздавала постройки на старой монастырской территории в формах украинского барокко. К началу XXI в. возведены Михайловский собор (2000 г.), колокольня, Экономические ворота, реконструированы Михайловская площадь и келейный корпус. В 2013 г. здания Киевского Златоверхого монастыря занимала община неканонической УПЦ Киевского патриархата, в Варваринском корпусе размещена так называемая Киевская православная богословская академия.