Согласно несохранившемуся синодику монастыря, первой настоятельницей Калужского  монастыря была игуменья Елена (Евдокия?), второй – игуменья Марина, которая «за свою старость и скорбь игуменийство cестрам здала» и, как полагают исследователи, приняла постриг в схиму. При игуменье Марине в Калужском монастыре проживали 36 сестёр, в том числе казначея Анисия, просвирня Дорофея, старицы Анна, Варвара и Иулия. В 1673 г. сёстры Калужского монастыря вместе с городским духовенством и посадскими людьми на чёрном Соборе избрали новую игуменью – насельницу девичьего Оптина болховского в честь Рождества Пресвятой Богородицы и Святой Троицы монастыря Мариамну. В обители хранилась грамота от 22 ноября 1679 г. митрополита Сарского и Подонского Варсонофия (Черткова), выданная в ответ на челобитную игуменьи Мариамны: митрополит благословил перевод в Калужский  монастырь её сестры, бывшей настоятельницы Оптина болховского монастыря игуменьи Елены (Пальчиковой). По розыску 1721 г., судья приказа Церковных дел настоятель московского во имя святителя Иоанна Златоуста монастыря архимандрит Антоний (ум. в 1726 г.) сообщал в Святейший Синод, что игуменьи Феодосия (около 1691 – 1692 гг.) и Гавдела (1720–1722 гг.) укрывали в обители раскольников. Ссылаясь на показания насельницы Калужского  монастыря монахини Евгении, архимандрит Антоний утверждал, что большая часть стариц монастыря уклонилась в «раскольническую прелесть». Архимандрит Антоний предлагал направить его или других «искусных священников» в Калугу для «уверения» сестёр. 16 сентября 1722 г. обитель возглавила игуменья Екатерина. В XVIII в. Калужский  монастырь служил местом ссылки за разные «вины». Так, в 1723 г. в Калужском  монастыре («за блудное беззаконство» с дьячком Ф. Никифоровым) была направлена Александра Андреевна Воейкова, разведённая с лейб-гвардии Преображенского полка сержантом А.Д. Марковым. К маю 1726 г. в Калужском  монастыре проживали 31 монахиня и 15 белиц, в 1751 г. – игуменья Ева и 30 монахинь, богослужения совершали два священника и дьякон. Во время Русско-турецкой войны насельницы Калужского  монастыря служили сёстрами милосердия и санитарками в Калужском госпитале. Ведомость 1904 г. упоминает о 32 штатных насельницах и 30 сверхштатных послушницах; по численности сестёр Калужский  монастырь уступал всем другим женским обителям и общинам Калужской епархии (Российский государственный исторический архив). Настоятельниц Калужского  монастыря традиционно погребали в Лаврентиевом калужском монастыре.