Необходимость защиты православной веры и церковнославянского языка как литургического и литературного языка православных славян, а также необходимость духовного просвещения и готовности к полемике определили актуальность издания выверенных библейских и богослужебных книг. Подготовкой «Острожской Библии» к изданию занимались члены Острожского кружка (см. Острожская академия) – культурно-просветительского и издательского центра, покровителем и идейным вдохновителем которого был князь К.К. Острожский. В конце 1576 г. князь открыл в Остроге, который перешёл в его собственность в середине 1570 гг., издательство и основал «славяно-греко-латинский» коллегиум, для преподавания в котором пригласил выдающихся учёных мужей того времени. В работе острожской библейской комиссии ведущая роль принадлежала ректору Острожской академии Г.Д. Смотрицкому и Ивану Фёдорову, который руководил технической реализацией этого выдающегося научного предприятия, определял графическое и шрифтовое воплощение книги, был одним из главных справщиков текста. Призванная стать опорой в религиозной полемике, «Острожская Библия» должна была, по замыслу её составителей, представить выверенный по многочисленным источникам древнейший перевод Библии на славянский язык. Решение этой задачи поставило острожскую комиссию перед рядом текстологических проблем, которые были перечислены князем К.К. Острожским в предисловии к «Острожской Библии». В Западнорусской митрополии не было известно полное собрание ветхозаветных книг на церковнославянском языке, но из Москвы издателям удалось получить Библию, переведённую с греческого языка. Дополнительно были собраны Библии и на других языках. При этом было установлено, что между этими текстами существуют значительные расхождения, поэтому были предприняты поиски исправных текстов в греческих, сербских и болгарских монастырях. Был найден «звод» греческой Библии, наиболее близкий к еврейскому и славянскому текстам, которому и решено было следовать. Йозеф Добровский первым установил, что присланной из Москвы Библией была Геннадиевская Библия 1499 г. Это наблюдение Йозефа Добровского было подтверждено исследованиями Александра Васильевича Горского и Капитона Ивановича Невоструева, Ивана Евесеевича Евсеева. Текст Геннадиевской Библии, который был получен князем К.К. Острожским в 1571 (или 1573) г. при посредничестве канцлера Великого княжества Литовского Михаила Богдановича Гарабуды, стал основой редакционной работы острожской библейской комиссии, он исправлялся по греческому изданию Септуагинты, как полагают исследователи, по Альдинской Библии 1518 г. В круг других источников «Острожской Библии» входили Вульгата, чешская Библия Мелантриха, «Библия руска» Франциска Скорины, а также ряд славянских текстов.