В периоды долгого строительства храма Cвятой Софии, а затем его многочисленных перестроек и ремонтов основные события христианской жизни Константинополя были сосредоточены в храме святой Ирины. За этой церковью постепенно закрепилась роль храма при патриаршей резиденции. В 336 г. Константинопольский епископ Александр заперся в храме святой Ирины и несколько дней молился о Божьей помощи в разрешении спора с арианами, поскольку в это время император Константин I Великий потребовал от него принять Ария в церковное общение. Конфликт разрешился с неожиданной смертью Ария. В 337 г. в храме святой Ирины был рукоположён во епископа Константинополя святой Павел Исповедник, но вскоре из-за противодействия партии сторонников диакона Македония он был низложен и сослан в Фессалонику. Епископом стал Евсевий Никомидийский, после его смерти в 341 г. святой Павел пытался вернуться на кафедру. Когда префект Константинополя Филипп по приказу императора Констанция II вёз Македония (которого он поддерживал) на колеснице к храму святой Ирины для рукоположения, рядом с храмом они встретили яростное сопротивление толпы народа. Солдаты, сопровождавшие префекта, силой проложили путь к храму, причём погибли 3150 жителей: часть погибли под натиском толпы, некоторые были убиты охраной префекта. С этого момента до 380 г. церковная власть в Константинополе оставалась в руках ариан, им же принадлежал и храм. Согласно Житию преподобномученика Стефана Нового, в 381 г. в храме святой Ирины проходили заседания второго Вселенского Собора, который окончательно утвердил Символ веры и осудил арианство. Иоанн Златоуст в период епископства в Константинополе (398–404 гг.) произнёс ряд проповедей в храме святой Ирины. В 404 г., во время волнений, вызванных ссылкой Иоанна Златоуста, базилика Святой Софии была сожжена, и до 415 г. храм святой Ирины был главным городским храмом. Согласно преданию, в 447 г. в храме святой Ирины был погребён мальчик, вознесённый на небо во время землетрясения в Константинополе и слышавший там ангельское пение «Трисвятого». В 465 г. большой пожар, уничтоживший часть центра Константинополя, едва не перекинулся на храм святой Ирины, но на этот раз храм не пострадал (историк называет здесь храм святой Ирины храмом «Единодушия»). 13–15 января 532 г., во время восстания «Ника», храм святой Ирины сгорел, как и весь центр Константинополя. Свидетель событий Прокопий Кесарийский писал, что сильный ветер перебросил пламя с крыши дворца префекта претория на храм святой Ирины, огонь уничтожил на своём пути термы Александра и странноприимные дома Еввула и Самсония вместе с их пациентами. Восстановление храма было включено в большой проект императора Юстиниана I Великого по строительству на месте руин нового центра Константинополя, в том числе собора Святой Софии. Сохранившийся архитектурный облик храма святой Ирины по большей части относится к эпохе Юстиниана I Великого. В декабре 564 (или 563) г. новый пожар в Константинополе уничтожил значительную часть построек центра, в том числе два монастыря рядом с храмом святой Ирины, а также часть его атриума и нартекса. Исследователи полагают, что утраты были вскоре восстановлены.