Согласно позднему преданию, записанному в начале XIX в. Константином Фёдоровичем Калайдовичем, преподобный Мефодий по благословению преподобного Сергия Радонежского поселился в пустынном месте в дубовом лесу, окружённом болотами, за рекой Яхромой. Здесь он построил келью. Когда собралась братия, по совету своего наставника преподобный Мефодий переселился на более удобное место, к устью реки. По преданию, преподобный сам носил («пеш нося») брёвна для постройки монастыря через реку, названную с тех пор Пешноша. Иногда уходил для уединённой молитвы в часовню пророка Иоанна Предтечи, расположенную на расстоянии двух вёрст от обители. В XVII в. появились утверждения, что преподобный Сергий Радонежский посетил Мефодиев Пешношский монастырь в 1382 г., однако ни в одной из редакций его Жития, написанного преподобными Епифанием Премудрым и Пахомием Логофетом (Сербом), это событие не было отмечено. Между 22 февраля 1522 г. и 25 августа 1530 г. дворянин Василий Иванович Пересветов, посол удельного князя Юрия (Георгия) Ивановича, был отправлен на переговоры из Дмитрова в Москву. Речь на них шла о подтверждении прежних жалованных грамот и сохранении размеров митрополичьих даней и пошлин, которые пересылались из Мефодиева Пешношского монастыря Московскому митрополиту Даниилу, потребовавший от местного келаря и братии обители «грамот жаловалных прежних митрополитов», которые они ему «не являли» («Акты исторические», том  1). Учитывая время правления в Дмитрове князя Петра, исследователи полагают, что наиболее ранняя из митрополичьих жалованных грамот властям Мефодиева Пешношского монастыря относилась к периоду архиерейства Киевского митрополита Фотия. Помимо князя Петра Дмитриевича Мефодиеву Пешношскому монастырю покровительствовали Дмитровские князья Юрий (Георгий) Васильевич и его племянник Юрий (Георгий) Иванович. К 1547 г. кроме указанных сёл за Мефодиевом Пешношским монастырём числились монастырские купли села Широбахшино, сельцо Васильково с деревнями и меновные деревни в Лутосне, расположенные в Каменском стане, сельцо Базарово и сельцо Шилково Вышегородского стана Дмитровского уезда, а также сельцо Яхромское с деревнями в Дубенском стане Кашинского уезда. При этом общая пашня в этих монастырских владениях достигала 11 сох. Исследователи считают характерным, что в середине XVI в. земельные владения монастыря находились на территории Дмитровского и Каширского уездов, т.е. на землях княжества Юрия Ивановича. Исследователи полагают, что тогда же Мефодиев Пешношский монастырь получил право сбора таможенных пошлин в Дмитрове, и эти средства позволили приступить к строительству в монастыре каменного собора. Но в 1549 г. Мефодиев Пешношский монастырь лишился права собирать таможенные пошлины в Дмитрове и селе Кимре (ныне город Кимры Тверской области). В первой четверти XVI в. в Мефодиевом Пешношском монастыре был возведён Никольский собор, что положило начало каменному строительству в обители. В конце августе 1578 г. мимо Мефодиева Пешношского монастыря проехало датское посольство во главе с Якобом Ульфельдтом. Он утверждал, что его спутники «по дороге видели монастырь св. Николая, отлично построенный из камня наподобие крепости».