Архиепископ Сергий (Спасский) отметил упоминание Исидора Твердислова в Уставе Исторического музея и в святцах XVI в. В послании к царю Ивану IV Васильевичу Грозному, написанном Макарием в 1552 г., Исидор Твердислов не назван среди русских святых. Он упомянут в царском послании 1563 г., где Иван IV Грозный сообщает Макарию о взятии Полоцка. По преданию, Иван IV в благодарность святому за помощь при взятии Полоцка повелел в 1565/1566 г. построить над могилой Исидора Твердислова вместо деревянной церкви каменный храм (зодчий Андрей Малой). По мнению Евгения Евстигнеевича Голубинского, общецерковная канонизация Исидора Твердислова состоялась между 1549 и 1563 гг. Включение Жития Исидора Твердислова в Софийский том Великих Миней Четьих (Российская национальная библиотека, 1547 г.) подтверждает, что к 1547 г. почитание Исидора Твердислова уже было общерусским. Память святого отмечена в печатном Уставе 1610 г. Его Житие включено в Тулуповские Четьи-Минеи (Российская государственная библиотека, 1630 г.), Четьи-Минеи Иоанна Милютина, «Книгу житий святых» Димитрия Ростовского. По наблюдениям Елены Константиновны Минеевой, начиная с XVI в. Житие Исидора Твердислова встречается в рукописях не реже, чем Сказание о св. князьях Борисе и Глебе или Житие Леонтия Ростовского, т.е. наравне с повествованиями о первых русских страстотерпцах и об «апостоле земли Ростовской». В 1786 г. к ростовской Вознесенской церкви, где почивают мощи блаженного, с юга был пристроен тёплый придел во имя Исидора Твердислова. В арке между храмом и приделом находилась серебряная гробница святого, устроенная в 1817 г. В 1930 г. храм был закрыт и передан в ведение Ростовского музея, в его помещениях размещались склады, магазины и др. В 1950 гг. началась реставрация здания, были разобраны пристройки XVIII–XIX вв., в том числе придел во имя Исидора Твердислова. В 2002 г. в Вознесенской церкви возобновились богослужения, над мощами Исидора Твердислова установили раку. В 2007 г. во имя Исидора Твердислова была освящена надвратная часовня в женском монастыре в честь иконы Божьей Матери «Нерушимая Стена» в Апшеронске (Краснодарский край, архитектор Юрий Степанович Субботин; см. «Нерушимая Стена» иконы Божьей Матери женский монастырь). Изображения Исидора Твердислова встречаются в иконописи, в книжной миниатюре и графике, в монументальных росписях храмов, на окладах Евангелия, в произведениях лицевого шитья, резьбы по дереву, ростовской финифти (живопись по эмали). Особенности иконографии Исидора Твердислова – короткая борода, волосы длинные или короткие, одежда состоит из куска ткани, переброшенного через плечо так, что другое плечо и половина груди обнажены, ноги до колен и выше неприкрыты. Как правило, он представлен в молении, иногда в руке кочерга, реже крест. В иконописных подлинниках XVII–XIX вв. под 14 мая облик Исидора Твердислова уподобляется внешности Спасителя, Николая Чудотворца, великомученика Никиты или других святых: «Рус, власы велики, брада Христова, плече правое наго, риза санкир» (вторая четверть XVII в.; Российская национальная библиотека); «Рус, брада аки Николы, власы велики, правое плечо наго, ризы санкирь, родом немчин» (последняя четверть XVII в.; Институт русской литературы); «Рус, брада Никиты, власы велики, правое плечо наго, в руце крест, ноги голы, риза санкирь едина, а в киевских листах Исидор млад, мученик» (конец XVIII в.; Библиотека Академии Наук Строг; см. также: Институт русской литературы); «Рус, брада аки Козмина, власы с ушей, как у Фрола, в рубашке, бос» (1820 гг.; Российская национальная библиотека; под 4 ноября, назван юрьево-повольским юродивым); «Рус, брада аки Николина, власы велики, правое плечо наго, в руце крест, ноги голы» (1840 гг.; Институт русской литературы).