В 530 гг. Иоанн Эфесский совершил ряд путешествий: в 532 г. побывал в Антиохии, сопровождая диаконов Фому и Стефана из Амиды; в 534–535 гг. посетил египетскую Нитрийскую пустыню, где жил Фома, и Константинополь, где в то время находился Стефан. Когда Антиохийский патриарх Ефрем (526–545 гг.) возобновил преследование антихалкидонитов, Иоанн Эфесский вновь был изгнан вместе с монашеской общиной. Монахи переселились в монастырь Хавраниата, однако вскоре были вынуждены уйти в горную местность в долине Евфрата, в монастырь Гаузе близ селения Абдехир. Через три года они перешли в монастырь на правом берегу Евфрата, вблизи Клавдиополя Каппадокийского. Около 540 г. Иоанн Эфесский вновь ездил в Египет, затем отправился в Константинополь. На острове Родос он встретил Гефестопольского епископа Иоанна Египтянина и с ним посетил провинцию Асия, где помогал ему при совершении таинств и рукоположений в общине монофизитов. В 542 г. в Константинополе Иоанн Эфесский был свидетелем начавшейся эпидемии чумы; в это время он стал настоятелем монофизитского монастыря св. Мары в предместье Сики. Исследователи полагают, что в период краткого пребывания в Константинополе Иоанн Эфесский был рукоположён во пресвитера. В 542–543 гг. император Юстиниан I Великий поручил ему миссионерскую деятельность среди сельского населения внутренних районов Малой Азии. Этот период жизни Иоанна Эфесского известен несколько лучше благодаря сохранившимся фрагментам его «Церковной истории». Сфера его деятельности распространялась на провинции западной Малой Азии (Асия, Фригия Пакатиана, Кария и Лидия). В окрестностях Тралл, на месте разрушенного языческого храма, им был основан монастырь Дарира. За годы миссионерства Иоанн Эфесский крестил около 70 тыс. человек, построил более 90 храмов, десять монастырей и четыре странноприимных дома. Он был миссионером не только среди язычников, но и среди иудеев (семь синагог превратил в храмы). Иоанн Эфесский столкнулся с остатками монтанизма: около 550 г. в деревне Пепуза обнаружил пользовавшиеся почитанием останки Монтана и пророчиц Максимиллы и Прискиллы и повелел их сжечь. Деятельность Иоанна Эфесского поддерживалась императорской казной: из Константинополя ему присылали книги, сосуды и облачения для вновь основанных храмов. Иоанн Эфесский получал помощь из родной Амиды, куда он ездил в 548 г. Благодаря императорской поддержке Иоанн Эфесский имел свободу действий и независимость от местного православного епископата. В 548 г., когда между ним и епископом Тралл возник спор из-за того, кому принадлежит местность Дарира, и епископ, желавший устроить там свою летнюю резиденцию, обратился с жалобой к Юстиниану I, тот решил дело в пользу Иоанна Эфесского. Кроме того, епископ был обвинён в неумелом руководстве и был вынужден подчиниться Иоанну Эфесскому, передать в его распоряжение городскую церковь и странноприимный дом.