В 1878 г. мастером Н. Ахапкиным был сделан новый пятиярусный иконостас в русско-византийском стиле на средства статского советника С.П. Страхова и купца А.В. Пуллинова; освящён 28 августа епископом Можайским Алексием. Поновленный в 1913 г. тем же мастером иконостас был разобран (без фотофиксации) в 1926 г., тогда же были обнаружены следы древних врубок в стены и одно старое (XVII в.?) тябло. Из других икон собрания музея-заповедника «Коломенское» был смонтирован «музейный» четырёхярусный иконостас (разобран в 1960 гг.). В храме были особые деревянные, обитые тканью места для царской семьи. Документы XVII в. упоминают фрески в интерьере, утраченные к XVIII в.; в XIX в. стены покрывала роспись с архитектурными мотивами (не сохранилась). На восточной паперти, рядом с «троном», на стене было фресковое изображение Собора Вселенских святых и московских чудотворцев (не сохранилось). Нетрадиционное архитектурное решение церкви Вознесения Господня в Коломенском, как полагают исследователи, обусловило постройку храма вне Кремля и города. Личность архитектора (архитекторов?) остаётся предметом дискуссий: Иван Егорович Забелин считал, что это был русский мастер, по мнению В.Н. Подключникова и Юрия Павловича Спегальского, вероятнее, из Пскова, чем из Москвы, другие исследователи, отмечавшие черты итальянского Ренессанса (Константин Константинович Романов, Николай Николаевич Воронин, Валентин Александрович Булкин, Сергей Сергеевич Подъяпольский), полагали, что он был приглашён из Европы и состоял на русской службе. Участие в работах мастеров из Западной Европы подкрепляется датой от Рождества Христова, вырезанной арабскими цифрами на одном из верхних камней пилястр: «(1)533». В настоящее время наиболее признаны гипотезы об авторстве итальянского зодчего Петра Ганнибала (в русских источниках – Петрок Малой), строителя храма в честь Воскресения Христова в Кремле (1532–1543 гг.) и стен Китай-города (1535–1538 гг.), либо иного, неизвестного мастера. Церковь Вознесения Господня в Коломенском не имеет исторических аналогов по типу и архитектурным формам. Долгое время господствовала теория И.Е. Забелина о том, что строитель пытался воспроизвести тип деревянного шатрового храма в камне; её подкреплял текст XVI в., в котором упомянуто, что верх церкви Вознесения Господня в Коломенском устроен «на деревянное дело». Но сходство с русскими деревянными церквами более позднего времени, по мнению исследователей, не может служить решающим аргументом. Стиль архитектуры церкви Вознесения Господня в Коломенском напоминает исследователям храм Гроба Господня в Иерусалиме и другие храмы на Святой земле, повлиявшие на архитектуру Италии и других стран Европы в XIII–XIV вв. В Западной Европе в церквах, часовнях и колокольнях (особенно в Италии) использовали шатровые формы в завершениях, а в России эта форма, по мнению исследователей, была типична для надпрестольных кивориев и сеней. Свободное обращение с ордером, варьирование ренессансных либо по-ренессансному трактованных готических (вимперги) и русифицированных (кокошники) мотивов, композиция освещения – всё это характерно не для русского зодчества, но для западноевропейской архитектурной традиции. К очевидным приметам архитектуры Высокого Возрождения исследователи относят геометрически чёткую форму плана, свойственную Антонио Палладио; использование единого ордера в интерьере и на фасадах; продуманная цельность и гармоничность конструкции и декора. Храм-памятник в форме своеобразного «обелиска», поднятого на обходную галерею на аркадах и сложный постамент-подиум, близкий к типу центрического храма, активно разрабатывался теоретиками архитектуры Ренессанса (Антонио Филарете (Аверлино) и др.). О хорошем знакомстве мастера с искусством Ренессанса свидетельствует и трон на восточной галерее. Церковь Вознесения Господня в Коломенском оказала решающее влияние на сложение шатровых, столпообразных и многостолпных русских храмов середины XVI в., определив одну из главных тенденций в развитии церковной архитектуры Московской Руси. В 1994 г. внесена во Всемирный список культурного наследия ЮНЕСКО.