После смерти бездетного князя Фёдора (ум. в 1513 г.) земли Волоцкого княжества перешли великому князю Василию III Ивановичу. В начале XVI в. покровительство Возмицкому монастырю оказывала также мать князя Фёдора княгиня Иулиания Михайловна, в ноябре 1503 г., перед кончиной, она завещала монастырю «Пречистой на Возмищо» село Михайловское «на Волоке» и была похоронена в Возмицком монастыре. В том же году её сын Рузский князь Иван Борисович пожаловал Возмицкому монастырю Булгаковские деревни, а также деревни Кривошеино и Бучнево на реке «Волцне» (современная река Волошня) в Льняниковском стане «со всем тем, что к тем деревням потягло истарины». Первоначально Возмицкий монастырь входил в Новгородскую епархию, с 1613 г. – в Патриаршую область. Исследователи полагают, что до середины XV в. монастырём управляли игумены, затем архимандриты (в 1724 г. братия писала в Святейший Синод о том, что монастырь был «изстари степенной... и архимандриты в нём издревле бывали с шапками»). В 1517 г. настоятелем обители был поставлен архимандрит Акакий, в 1522 г. хиротонисанный во епископа Тверского, около 1553–1554 гг. – Герман (Садырев-Полевой), с 1564 г. – архиепископ Казанский. Архимандрит Возмицкого монастыря Сильвестр участвовал в Соборе 1580 г., который запретил архиереям и монастырям приобретать вотчины. Согласно Типографской летописи (Полное собрание русских летописей, том 24) и Пафнутьеву летописцу, в обитель «на Возмища» по приговору Собора 1525 г. был сослан архимандрит Новоспасского монастыря Савва Грек (Святогорец; по другим источникам, Савва был сослан в Левкиев монастырь). Как и вся Волоколамская волость, Возмицкий монастырь пострадал в Смутное время. В «Росписи русского войска, посланного против самозванца» 1604 г. упомянуты «служки монастырские» Возмицкого монастыря: 16 человек «конных да 14 лошадей». Согласно донесению воеводы Тимофея Торбеева 1615 г., «церковь возминска с литовского разорения стоит без кровли и нутрь подрана, а деисус хищен, и обитель вся пуста есть» (Российский государственный архив древних актов). Вскоре обитель была восстановлена, в 1653 г. в ней жили архимандрит Авраамий с 12 насельниками. По Уложению 1649 г., «за бесчестье» архимандрита «с Волока Ламского Возмицкого монастыря» полагалось 20 руб. штрафа, «за бесчестье» келаря – 15 руб., казначея – 10 руб. Настоятели Возмицкого монастыря участвовали в церковной жизни города. По грамоте Московского  патриарха Адриана в 1699 г. архимандрит Маркелл разрешал спор между волоколамскими священниками Моисеем и Космой по поводу земель Рождественской церкви «на посаде». Архимандрит Иосиф в 1720 г. освятил новую деревянную Покровскую церковь «на посаде», в сентябре 1723 г. – церкви Рождества Христова и Сергия Радонежского.