Счастливая супружеская жизнь Изабеллы окончилась в июле 1491 г., когда Афонсу погиб, упав с лошади. Принцесса была убита горем и позже убедила себя, что Господь пожелал смерти её молодого супруга из-за того, что в Португалии получило убежище множество евреев, изгнанных из Испании родителями самой Изабеллы. По просьбе родителей Изабеллу отправили обратно в Испанию. Принцесса вернулась на родину искренне религиозной и объявила о строгом посте и самобичевании, которым собиралась подвергать себя до конца жизни в знак траура по Афонсу. Она также заявила, что никогда больше не выйдет замуж. Родители, казалось, смирились с таким решением дочери, однако после смерти короля Португалии Жуана II в 1495 г., его преемником стал брат его жены Мануэл I, который сразу же стал просить руки Изабеллы. Фердинад II Изабелла I, пожалуй, уважали желание дочери и предложили Мануэлу в качестве жены другую свою дочь, Марию, но король отказался. Ситуация оставалась сложной вплоть до того момента, когда принцесса Изабелла дала согласие на брак при условии, что Мануэл изгонит из Португалии всех евреев, которые не перешли в христианство. Мануэл согласился с условием и в сентябре 1497 г. пара поженилась. В год заключения второго брака Изабелла была провозглашена принцессой Астурийской и наследницей Кастильской короны ввиду смерти единственного на тот момент брата принцессы, Хуана Арагонского, в сентябре 1497 г. и рождения у него мёртвой дочери. Сразу же после этого Филипп, муж одной из младших сестёр Изабеллы, Хуаны, стал претендовать на корону. Католические короли, чтобы пресечь притязания Филиппа, в начале 1498 г. собрали в Толедо кастильский двор, где Изабелла и её супруг были приведены к присяге в качестве законных наследников Кастильской короны. Затем с той же целью был созван двор в Сарагосе. Хотя наследование трона женщиной было разрешено в Кастилии (о чём свидетельствует пример Изабеллы I), Фердинанд II сомневался, стоит ли отдавать Арагон в женские руки. Тем не менее, Изабелла стала наследницей и Арагона, хотя в случае рождения у неё сына наследником престола стал бы именно он. На момент решения вопроса о наследнике Арагонской короны Изабелла была беременна, и 23 августа 1498 г. в Сарагосе она родила сына, названного Мигелом. Изабелла скончалась в течение часа после рождения мальчика. Причиной смерти, как полагают исследователи, стали постоянные посты и самобичевание или же частые поездки на поздних сроках беременности. Мигел вскоре был назван наследником Португальского королевства, Кастильской и Арагонской корон. По просьбе Изабеллы её похоронили в монашеском одеянии в монастыре Санта-Исабель в Толедо. Перед смертью Изабелла I попросила перенести тело дочери в Гранаду, где собиралась упокоиться кастильская королева, однако её желание так и не было выполнено. Через два года после смерти первой жены и чуть больше, чем через три месяца после смерти их сына, Мануэл I женился на младшей сестре Изабеллы, Марии, от которой он отказался когда-то в пользу Изабеллы. Однако со смертью Изабеллы Мануэл утратил шанс заполучить Кастильское королевство, а со смертью самого Мануэла была утрачена и надежда объединить Иберийские королевства.