В 1843 г. решением Священного Синода РПЦ в бывших корпусах базилианского монастыря был учреждён православный второклассный женский монастырь. Две насельницы-базилианки были переведены в Вольнянский монастырь под Новогрудком. По просьбе архиепископа Литовского и Виленского Иосифа (Семашко) архиепископ Могилёвский Исидор (Никольский) направил в Гродненский монастырь шесть монахинь и четырёх послушниц из православных монастырей – оршанского в честь Успения Пресвятой Богородицы, буйничского в честь Сошествия Святого Духа на апостолов и др. Настоятельницей назначена бывшая насельница оршанского монастыря игуменья Афанасия (1843–1861 гг.), затем – игуменья Анастасия (Успенская; 1861–1876 гг.). Опёку над новообразованной обителью осуществлял архимандрит гродненского Борисоглебского монастыря Игнатий (Железовский). Духовником монастыря был священник Иоанн Теодорович, автор «Историко-статистического описания Волынской епархии» и других публикаций о волынских древностях. При открытии Гродненского монастыря в 1843 г. было назначено ежегодное пособие 2155 руб. серебром. Императорским указом от 17 февраля 1845 г. Гродненскому монастырю был передан «земельный плац и здание упразднённого католического монастыря бонифратеров». К 1865 г. монастырь владел двумя земельными участками размером 360 десятин, имениями Грандзичи (Грандичи) и Русота, фруктовым садом, мельницей, рыбным озером. В 1874 г. Гродненскому монастырю была передана часть суммы (2500 руб.) упразднённых монастырей Литовской епархии. Осенью 1864 г. по инициативе генерал-губернатора края Михаила Николаевича Муравьёва при Гродненском монастыре был создан приют для девушек-сирот из семей священнослужителей и дочерей бедного чиновничества, открыта библиотека. По ходатайству Гродненского епископа Иоакима (Левицкого) определением Синода от 25 июля 1900 г. Гродненский монастырь был переведён в урочище Красносток Гродненской губернии (ныне Ружанысток, Польша), в помещения бывшей доминиканской обители (упразднена в 1846 г.). В 1912 г. издан «Устав Свято-Богородицкого Красностокского женского общежительного монастыря». Монастырь в Красностоке стал основным, а в Гродно – приписным. Красносток был известен благодаря древней чудотворной Красностокской иконе Божьей Матери, подаренной, по преданию, в XVI в. князем Урусовым семье подляшского воеводы Василия Тышкевича. Им был возведён православный храм, где, как полагают исследователи, и находилась чудотворная икона. В 1663 г. икона перенесена в католический костёл, построенный на месте православного храма.