До 1406 г. доминирующим учением в университете был номинализм. Несмотря на то что впоследствии сторонники реализма во главе с Иеронимом Пражским возобладали в Гейдельберге, глава нового учения был изгнан с богословского факультета (1412 г.). Некоторые профессора университета приняли участие в Констанцском соборе, осудившем Яна Гуса как еретика. Становление и развитие гуманистического образования в университете, начавшееся при канцлере и епископе Иоганне фон Дальберге, связано с именами Рудольфа Агриколы, основателя старейшей в Германии гуманистической школы, Конрада Цельтиса, Якоба Вимпфелинга и Иоганна Рейхлина. Энео Сильвио Бартоломео Пикколомини (впоследствии папа Пий II), будучи настоятелем кафедрального собора в Вормсе, исполнял обязанности канцлера университета. 26 апреля 1518 г. в Гейдельберге состоялся диспут, в котором участвовали Мартин Лютер и монахи-августинцы. В публичных дебатах Мартин Лютер выдвинул сорок богословских и философских тезисов, которые впоследствии легли в основу доктрины оправдания верой. В университете поначалу отнеслись к Реформации спокойно, только некоторые профессора поддержали новое учение. Курфюрст Людвиг V приказал учинить расследование по этому делу (1523 г.), однако санкции властей лишь спровоцировали рост интереса к учению Мартина Лютера. С 1545 г. для Гейдельберга и всего Пфальца стало характерным сосуществование разных конфессий вплоть до официального введения там лютеранства как государственного вероисповедания. В 1551 г. профессора университета разных конфессий, протестант Г. Штолль и католик М. Койлер, представляли Пфальц на Тридентском соборе. Последние курфюрсты-католики, Людвиг V и Фридрих II, следуя рекомендациям советников из числа преподавателей университета, сделали попытку постепенного его реформирования. Но им удалось лишь внести изменения в устав факультета свободных искусств. В 1556 г. Фридрих II основал Коллегию мудрости, в которой за счёт средств курфюрста обучались шесть – восемь бедных, но талантливых студентов. С разрешения папы Римского Павла IV Коллегия мудрости была переведена в пустующий августинский монастырь. В правление Фридриха III (1559–1576 гг.) монастырь был преобразован в протестантскую консисторию (1561 г.), а коллегия передана в ведение богословского факультета. В правление Отто Генриха, сделавшего лютеранство государственной религией (1556 г.), в Гейдельберг был совершён иконоборческий погром (1557 г.), а последние два профессора-католика были лишены кафедр в университете. Проводимые Отто Генрихом реформы, направленные на создание единой системы образования, затронули систему финансирования университета и структуру его управления, факультетскую организацию, изменили количество, тематику и структуру предметных курсов. Факультет свободных искусств был приравнен к «высшим» факультетам. В качестве подготовительного отделения при университете была открыта грамматическая школа (1560 г.). Также изменился порядок назначения профессоров, из числа которых позднее стали выбирать проректора. Главными вдохновителями реформы стали Филипп Меланхтон и брат курфюрста граф Георг-Иоганн, ставший в 1556 г. ректором университета. В результате проводимой Отто Генрихом и его преемниками конфессиональной политики университет превратился в учебное заведение сначала лютеранского, а затем кальвинистского толка.