После смерти раненного при осаде Руана мужа (17 ноября 1562 г.) она открыто способствовала укоренению кальвинизма в своих владениях. В 1563 г. кардинал Жорж д'Арманьяк, архиепископ Тулузский, обратился к Жанне д'Альбре с обширным посланием и призвал королеву Наварры отказаться от мер, принятых ею в пользу «реформированной религии». Письмо кардинала и подробный ответ Жанны д'Альбре, отвергнувшей предложение папского легата, были сразу же опубликованы (1563, 1564 гг.). Только благодаря вмешательству королевы Екатерины Медичи дело Жанны д'Альбре как еретички не было вынесено на рассмотрение папского суда. В 1565 г. королева Наварры вновь прибыла к королевскому двору Франции и смогла вернуться в свои владения лишь в конце января 1567 г. С 1563 г. Жанна д'Альбре издала ряд законов, реорганизовавших протестантскую церковь в Наварре и Беарне. Запрещалось католическое богослужение, подданные Жанны д'Альбре были обязаны либо принять кальвинизм, либо покинуть её владения. Имущество католической церкви было передано кальвинистским общинам (из полученных денег каждая община должна была предусмотреть расходы в размере третьей части суммы на образование молодых членов общины и воспитание их в протестантском духе, третья часть предназначалась на попечение о бедных, оставшиеся деньги – на организацию протестантских богослужений). Протестантам передавались все католические церкви, монастыри закрывались, иконы, распятия, богослужебная утварь и почитавшиеся католические реликвии уничтожались. Так, в Вандоме гугеноты разграбили усыпальницу Бурбонов, предков мужа Жанныа д'Альбре, и сожгли покоившиеся там останки. В 1571 г. принятые Жанной д'Альбре законы были оформлены в виде «Церковного ордонанса» («Ordonnance ecclésiastique»). В 1563 г. на беарнском диалекте был опубликован «Катехизис» Жана Кальвина, в 1568 г. Арно де Салетт перевёл с французского на беарнский «Псалтирь» Клемана Маро (так называемая Женевская Псалтирь). В 1566 г. в городе Ортез была основана протестантская академия, где преподавали приглашённые из Женевы кальвинисты. Столица Наварры, город По, превратилась при Жанне д'Альбре в «новую Женеву», став укрытием для воинствующих гугенотов со всей Франции. Эти и другие меры привели к тому, что в начале 1568 г. в Нижней Наварре началось восстание католиков, которые обратились за военной помощью к испанскому королю. Сохраняя нейтральную позицию во время двух первых религиозных войн (1562–1563 и 1567–1568 гг.), в 1568 г. Жанна д'Альбре возглавила гугенотскую оппозицию. Отказавшись от роли посредницы между протестантской и католической партиями, которую ей предлагала Екатерина Медичи, королева Наварры и её сын присоединились к лидерам гугенотского лагеря, принцу Конде и адмиралу Гаспару де Колиньи, которым после обнародования королевского указа об их аресте удалось укрыться в портовой крепости Ла-Рошель на западном побережье Франции (август-сентябрь 1568 г.).