Из настоятелей Заиконоспасского монастыря XVII в. наиболее известны строители: до 1680 г. – иеромонах Симеон Полоцкий (ум. в 1680 г.), в 1680–1691 гг. – Сильвестр (Медведев). После кончины в 1703 г. игумена Палладия (Роговского) в Заиконоспасском монастыре была учреждена архимандрития; должность архимандрита была совмещена с должностью ректора академии. Многие из настоятелей становились архиереями, в том числе возглавлявшие Заиконоспасский монастырь: в 1703–1704 гг. – Рафаил (Краснопольский), в 1704–1705 гг. – Сильвестр (Крайский), в 1706–1722 гг. – Феофилакт (Лопатинский), в 1722–1728 гг. – Гедеон (Вишневский), в 1728–1731 гг. – Герман (Концевич; впоследствии архиепископ Архангелогородский; ум. в 1735 г.), в 1733–1736 гг. – Стефан (Калиновский), в 1737–1739 гг. – Митрофан (Слотвенский; впоследствии архиепископ Тверской), в 1741–1742 гг. – Кирилл (Флоринский), в 1742–1747 гг. – Порфирий (Крайский), в 1748–1753 гг. – Иоанн (Козлович; впоследствии епископ Переяславский; ум. в 1757 г.), 1757–1758 гг. – Геннадий (Драницын; впоследствии епископ Суздальский), в 1761–1763 гг. – Гавриил (Петров), в 1764–1768 гг. – Геннадий (Бронницкий; впоследствии епископ Переславль-Залесский; ум. в 1773 г.), в 1768–1770 гг. – Антоний (Герасимов-Забелин), в 1770–1774 гг. – Феофилакт (Горский), в 1774–1778 гг. – Амвросий (Подобедов), в 1778–1782 гг. – Дамаскин (Семёнов-Руднев), в 1782–1783 гг. – Павел (Пономарёв; впоследствии архиепископ Ярославский), в 1783–1786 гг. – Аполлос (Байбаков), в 1786–1788 гг. – Афанасий (Иванов), в 1792–1794 гг. – Мефодий (Смирнов), в 1795–1797 гг. – Евлампий (Введенский), в 1798–1799 гг. – Серафим (Глаголевский), в 1801–1804 гг. – Августин (Виноградский), в 1804–1808 гг. – Моисей (Близнецов-Платонов), в 1810–1814 гг. – Симеон (Крылов-Платонов), в 1814–1817 гг. – Евгений (Казанцев), в 1817–1819 гг. – Парфений (Чертсков), в 1833–1834 гг. – Исидор (Никольский), до 1842 г. – Иосиф (Богословский), в 1843–1853 гг. – Алексий (Ржаницын), в 1854–1859 гг. – Леонид (Краснопевков), в 1881–1884 гг. – Иосиф (Баженов), в 1884–1885 гг. – пребывавший на покое епископ Пётр (Екатериновский). Префектами академии были будущие архиереи Иннокентий (Кульчицкий), Гавриил (Бужинский), Платон (Малиновский), Иннокентий (Неронович), Ириней (Братанович), Иннокентий (Нечаев), Тихон (Малинин). Из преподавателей, проповедников академии, насельников монастыря иерархами стали Лука (Конашевич), Димитрий (Сеченов), Вологодский епископ Иосиф (Золотой; ум. в 1774 г.), Гедеон (Криновский), Ириней (Клементьевский), Дамаскин (Россов), Никанор (Клементьевский). В 1625 г. в монастыре числились игумен, диакон и пять человек братии, в 1692 г. – строитель, диакон и пять старцев. О религиозно-нравственном состоянии немногочисленной братии свидетельствуют поучения Симеона Полоцкого, в том числе «О питии заздравной чаши по поводу торжественных случаев», «Увещание к братии о еже во храм Божий ходили», «Увещание к братии о еже к началу богослужения приходити», «Увещание к крадущим», «Увещание к бегающим из монастыря», «Увещание к братии, упивающейся» и «Увещание ко священником ко исповеди частей», в которых он обличал иеродиаконов и иеромонахов за обыкновение служить литургию без должного приготовления.