В 1535 г. с южной стороны от Преображенского собора тверскими мастерами во главе с Ермолой был возведён храм во имя священномученика Григория с колокольней, освящён 6 августа следующего года Макарием (церковь (1445 г.) с таким же посвящением впоследствии была упразднена). Храм представлял собой восьмиугольную столпообразную постройку с ярусом звона и железными часами наверху. В 1549–1551 гг. к северо-западу от собора, на месте старой церкви Варлаама, был возведён каменный двухэтажный храм с таким же посвящением, в нём существовали два придела: южный во имя священномученика Исидора Пелусиота, северный во имя равноапостольных Константина и Елены, с запада к храму примыкала трапезная палата. Начиная с XVI в. Варлаамиев Хутынский монастырь был одним из центров церковной и политической жизни Новгорода и России, в 1608/1609 г. в монастыре была учреждена архимандрития. Многие русские архиереи были до хиротонии настоятелями или насельниками Варлаамиева Хутынского  монастыря. В 1539 г. одним из кандидатов на митрополичий престол являлся хутынский игумен Феодосий, в июне 1542 г. хиротонисанный во архиепископа Новгородского. В 1581 г. игумен монастыря Дионисий был хиротонисан во митрополита Московского и всея Руси, в 1620 г. архимандрит Киприан – во архиепископа Сибирского, в 1641 г. архимандрит Пахомий – во архиепископа Астраханского, в 1654 г. архимандрит Софроний – во архиепископа Суздальского. Ставший в 1704 г. настоятелем Варлаамиева Хутынского монастыря архимандрит Феодосий (Яновский) был ближайшим помощником Новгородского митрополита Иова и по поручению Петра I исполнял обязанности «духовного судии» в присоединённых к России городах: Ямбурге, Нарве, Копорье, Шлиссельбурге и строящемся Санкт-Петербурге (в 1721 г. хиротонисан во архиепископа Новгородского из архимандритов Александро-Невского монастыря). Хутынский архимандрит Вениамин в 1721 г. являлся кандидатом на Киевскую и Галицкую кафедру, архимандрит Лаврентий (Баранович) в 1774 г. был хиротонисан во архиепископа Вятского и Великопермского. В 1655 г. Варлаамиев Хутынский монастырь посетили Антиохийский  патриарх Макарий III и Сербский патриарх Гавриил. В XIII–XVI вв. монастырь владел одним из лучших книжных собраний Новгорода. К настоящему времени сохранились принадлежавшие монастырю Служебник, пергаменный Апостол 1391 г., список Иерусалимского устава начала XV в., Толковое Евангелие 1441 г., переписанное иеродиаконом Иовом для игумена Германа, комплект Миней 1463–1464 гг. и др. В Варлаамиевом Хутынском монастыре работал писец-каллиграф инок Закхей, отождествляемый некоторыми исследователями с игуменом обители Закхеем (1470–1480 гг., 1505–1507 гг.). Живя в Спасо-Преображенском монастыре в 1495 г., Закхей переписал для Варлаамиева Хутынского монастыря лицевое Евангелие («Закхеевское»), в 1506/1507 г. уже в Хутынском монастыре Закхей переписал ещё одно Евангелие. В 1550 гг. игуменом Варлаамиева Хутынского монастыря был Маркелл (Безбородый), составивший по поручению Московского митрополита Макария Жития Саввы Сторожевского и Новгородского святителя Никиты. В середине XVII в. Новгородский митрополит (впоследствии патриарх) Никон устроил в монастыре типографию, в которой в 1651 г. был напечатан перевод с греческого языка книги «Диоптра жизни человеческой». В начале 1610 гг. Варлаамиев Хутынский монастырь был занят шведскими отрядами, в монастырских корпусах размещалась квартира шведского военачальника Якоба Делагарди. Обитель подверглась незначительному разорению, были похищены серебряные и жемчужные украшения с гробницы Варлаама и несколько драгоценных окладов.