Членами братства, состоявшего под покровительством императорской семьи, стали православные архиереи, представители власти в Северо-Западном крае, выдающиеся российские государственные и общественные деятели. Пожертвования Виленскому братству поступали из разных частей империи, в 1866 г. в адрес братства поступило церковной утвари на 20 тыс. руб., в 1880 г. – на 30 тыс. руб. Кроме частных пожертвований братская касса пополнялась средствами, вырученными от благотворительных концертов, кружечных сборов, распространения книг, сдачи внаём недвижимости. В братстве существовал отдел содействия бедным и нуждающимся. В 1872 г. братство открыло приют для 12 сирот, в 1879 г. разместило в своём доме виленское 2-классное приходское училище, открыв в нём женскую смену. На содержании братства был дом с 40 квартирами для беднейших семей. В беднейших приходах епархии создавались ссудные кассы, на цели которых братство отпустило 3 тыс. руб. Высшим органом братства являлся выборный совет из 10–12 человек. В 1885 г. по предложению Литовского архиепископа Александра (Добрынина) совет братства принял на себя обязанности епархиального училищного совета. Совет организовал две учительские двухгодичные школы в Вильне и Гродненской губернии для подготовки преподавателей церковноприходских школ. В 1883 г. с Виленским братством объединилось Общество ревнителей православия. В конце 1894 г. был утверждён новый устав братства, согласно которому председателем совета и попечителем братства являлся правящий архиерей Литовской и Виленской епархии (раньше совет возглавляли епископы Ковенские, викарии Литовской епархии). С января 1895 г. братство возглавил архиепископ Литовский Иероним (Экземплярский), 18 марта 1895 г. братство взял под своё покровительство император Николай II. В это время число братчиков превышало 500 человек. В 1895 г. при братстве была создана комиссия нравственно-религиозных чтений. 20 января того же года открылась братская типография, которая к 1909 г. выпустила более 100 наименований книг. В 1907–1916 гг. два раза в месяц выходил «Вестник виленского Свято-Духовского братства», освещавший вопросы религиозно-нравственной и церковно-общественной жизни Северо-Западного края. В качестве приложений к «Вестнику» выпускались «Поучения на православные праздники», «Литовские епархиальные вести», «Листки для народа». Братство проявляло особую заботу о строительстве новых и восстановлении разрушенных православных храмов. По его инициативе в Вильне в конце XIX – начале XX вв. были построены четыре храма: во имя архангела Михаила и во имя князя Александра Невского, в честь иконы Божьей Матери «Знамение», Константино-Михайловский. В 1909 г. при братстве начал работу церковно-строительный комитет, занимавшийся сбором средств на строительство храмов в епархии. В августе 1909 г. по инициативе виленских братчиков в Вильне прошёл съезд представителей западнорусских православных братств, на который прибыли более 300 делегатов (архиереи, духовенство, государственные и общественные деятели из Литвы, Украины, Белоруссии и Польши). На съезде председательствовал архиепископ Литовский и Виленский Никандр (Молчанов). Главной целью съезда было объединение усилий для совместной деятельности – миссионерской, просветительской и хозяйственной. 24–25 сентября 1914 г. по пути на фронт Вильну посетил почётный председатель Виленского братства император Николай II. В Свято-Духовом храме ему была вручена высшая награда братства, знак первой степени – Золотая звезда. В августе 1915 г. в связи с приближением фронта бо́льшая часть православного духовенства и мирян, в том числе самая активная часть виленских братчиков, уехала в Россию, и после оккупации западных территории Российской империи немецкими войсками деятельность Виленского братства прекратилась. Последним попечителем и председателем совета братства был архиепископ Литовский (с 22 декабря 1913 г.), будущий Московский патриарх Тихон.