О нахождении Виленской иконы в Троицкой церкви в XVII в. свидетельствует завещание 1652 г. архимандрита Троицкого монастыря Алексия Дубовича, согласно которому в монастырь делался вклад в 100 злотых ежегодного дохода для совершения в Троицкой церкви перед Виленской иконой каждую субботу акафиста (возможно, перенесение иконы совершилось позднее и было вызвано запустением Пречистенской церкви, о чём свидетельствуют надпись 1748 г. на иконе, а также упоминание об этом событии в архивных документах Троицкого монастыря за 1775 г.). Во время Русско-польской войны (1654–1667 гг.) царём Алексеем Михайловичем была предпринята ещё одна попытка возвращения иконы из Вильно в Москву: русские войска заняли Вильно в 1655 г., а в 1657 и 1658 гг. князь Михаил Шаховской, назначенный Алексеем Михайловичем виленским воеводой, проводил по поручению царя розыски Виленской иконы, оказавшиеся безуспешными (некоторые исследователи XIX в. ошибочно полагали, что князь Шаховской искал Остробрамскую Виленскую икону Божьей Матери). Как показало проведённое русской администрацией Вильно в 1658 г. следствие, икона была вывезена виленским мещанином Юрием Селедчиком из Вильно по реке Вилии на лодке-витине в Крулевец (Кёнигсберг) и спрятана там униатскими монахами. После 1661 г. она была возвращена в Вильно. Виленская икона временно покидала Вильно и в годы Северной войны (1700–1721 гг.) – вместе со своим драгоценным окладом она была вывезена монахами василианского Троицкого монастыря в декабре 1701 г. в жировицкий Успенский монастырь. В Троицкой церкви икона была помещена в киот, устроенный в середине XVII в. на средства виленского бургомистра Юрия Павловича. Она в нём закрывалась задвижной завесой с изображением Благовещения (по другим источникам – Покрова Пресвятой Богородицы). После пожара в Вильно в 1706 г., истребившего всё убранство Троицкой церкви, но не повредившего Виленскую икону, униатское братство Непорочного зачатия Божьей Матери соорудило в 1707 г. новый, резной деревянный киот, а в 1713 г. вызолотило его. В Троицком монастыре икона находилась и после присоединения Вильно к России в 1795 г., и после ликвидации унии в 1839 г. По указанию Литовского архиепископа Иосифа (Семашко) в 1851 г. для Троицкой церкви взамен старой (униатской) алтарной преграды художником Иваном Хруцким, сыном белорусского униатского священника, был выполнен новый иконостас, в местный ряд которого, слева от царских врат, была помещена Виленская икона. Для удобства паломников перед ней находились ступеньки, а в дни больших праздников застеклённая рама киота снималась, и верующие могли свободно приложиться к иконе. Чтение Акафиста Богородице перед Виленской иконой совершалось на вечерне каждую пятницу и собирало большое число молящихся. За помощь и исцеления от болезней верующие украшали икону многочисленными приношениями – подвесками и серебряными пластинами.