В ноябре 1592 г. патриарх Иеремия II предоставил ставропигиальный статус братской Успенской церкви. Права братства впоследствии были подтверждены Константинопольскими патриархами Матфеем II в 1599 и 1600 гг., Кириллом I Лукарисом в 1626 г. (он присылал соответствующие грамоты и раньше, в бытность Александрийским патриархом – в 1611 и 1614 г.) и Парфением I в 1640 г., Иерусалимским патриархом Феофаном IV в 1620 г. В 1590–1591 гг. привилегии Львовского Успенского братства, в том числе ставропигиальный статус, были заверены на Брестских Соборах, принявших среди прочих решение о том, чтобы братства организовывались и в других городах. Основателями («фундаторами») и первыми членами Львовского Успенского братство были Стефан Мороховский, Алексей Феодорович Малечкий, Фома Иоаннович Бабич, Димитрий Диомидович и Иоанн Диомидович Красовские, Василий Теневич Гдешицкий, Дорофей Омелианович Саприка, Фома Афанасьевич, Иоанн Иоаннович Богатырец, Лука Григорьевич Губа, Георгий Козмич Рогатинец, Андрей Рогатинец, Иоанн Козьмич Рогатинец, Константин Корпиактос, Манолис Арфанис Маринетос, Иоанн Зенькович, Иоанн Бруханский. К Львовскому Успенскому братству позднее присоединились Киевский митрополит Михаил (Рогоза), князья Адам Вишневецкий, Кирик и Роман Ружинские, а также шляхтичи, занимавшие видные посты в Польско-Литовском государстве: волынский чашник Лаврентий Древинский, Адам Григорьевич Кисель, староста вроцлавский и нежинский Павел Иванович Тетеря, воевода киевский и староста чигиринский Иван Евстафьевич Выговский и многие другие. Членами братства были молдо-влахийские господари, дававшие средства на строительство братской Успенской церкви. Братство оказывало помощь своим членам: деньгами, уходом за больными. Тело умершего братчика должны были провожать в последний путь со свечами все члены организации. Ежегодно служились заздравные и заупокойные литургии за всех членов братства и членов их семей, в такие дни из братской казны раздавалась милостыня. Важной частью деятельности Львовского Успенского братства в конце XVI – начале XVII вв. была борьба за равноправие православных «русских» мещан с католическим населением Львова. Братство предпринимало акции против ущемления прав православных со стороны католиков, против насаждения унии и католицизма: подавало протесты в суды, выступало на сеймах. С 1599 г. имеются сведения о соглашениях между 11 львовскими братствами во главе с Львовским Успенским братством о действиях для посылки объединённых делегаций на сеймы. В 1592 г. братство с просьбой о помощи обратилось к царю Фёдору Ивановичу, полученные соболя были проданы за 550 злотых. Новое посольство в Москву в правление Лжедмитрия I принесло 950 злотых. Поездка, о которой стало известно, вызвала резкое недовольство властей. Король Сигизмунд III в 1606 г. требовал арестовать послов братства.