17 сестёр обители во главе с Елизаветой Фёдоровной, давших обет послушания, нестяжания и целомудрия без монашеского пострига и обещавших творить добрые дела в духе христианской любви, заботы о бедных и больных. 10 апреля 1910 г. Московским митрополитом Владимиром Елизавета Фёдоровна была утверждена в должности настоятельницы. Духовно окормляли сестёр протоиерей Митрофан Сребрянский и Алексий (Соловьёв), монах Зосимовой пустыни. Сёстрами могли стать православные вдовы и девушки в возрасте от 21 до 40 лет. Их подразделяли на крестовых (более опытных) и учениц. Все сёстры после прохождения соответствующего обучения в обители были обязаны посещать бедных и оказывать им помощь. В обители бесплатно обучали на курсах медсестёр, выдавали лекарства, проводили электролечение, делали массаж, инъекции, оперировали; работала библиотека; были созданы приют для сирот, воскресная школа, столовая для бедных, в которой готовилось свыше 300 обедов ежедневно. Кроме непременного участия в богослужениях два раза в неделю духовник обители проводил с сёстрами беседы катехизического и святоотеческого характера. В храме обители четыре раза в неделю читались акафисты. Сёстры при посвящении получали кипарисовый крест на белой ленте (с изображением Нерукотворного Спаса и Покрова Пресвятой Богородицы; на обратной стороне – образы святых жён Марфы и Марии) и чётки. Ежедневно каждая должна была творить сто Иисусовых молитв. В интерьере обители преобладал белый цвет, в убранстве использовался ситец светлых тонов. Сёстры носили специально сшитые для них светлые длинные платья и белые апостольники, напоминавшие одеяние Елисаветы Тюрингской. В 1911 г. Елизавета Фёдоровна подала в Святейший Синод прошение о присвоении старшим сёстрам Марфо-Мариинской обители звания диаконисс. Решение вопроса было отложено до Поместного Собора РПЦ. В 1908–1912 гг. был построен Покровский храм обители в новгородско-псковском стиле XVI в. по проекту архитектора Алексея Викторовича Щусева и расписан художником Михаилом Васильевичем Несторовым. Павел Дмитриевич Корин расписывал подземный храм-усыпальницу. 8 апреля 1912 г. состоялось освящение храма митрополитом Владимиром, епископом Трифоном и Серпуховским епископом Анастасием (Грибановским). Деятельность Марфо-Мариинской обители была обращена на поддержку бедных, больных и страждущих. Сёстры служили в бесплатных учреждениях обители: больнице, амбулатории, аптеке, приюте для сирот, воскресной школе, библиотеке, столовой для бедных, доме для чахоточных женщин на Донской улице. В обители больные получали и духовную помощь: соборование, беседы, молитвы, ежедневные службы о болящих в церкви святых Марфы и Марии. С осени 1913 г. сёстры оказывали медицинскую помощь обитателям ночлежных домов Хитрова рынка, бездомные дети препровождались в приюты. Одновременно с созданием Марфо-Мариинской обители в Москве под руководством Елизаветы Фёдоровны в Сергиевском посаде в 1910–1911 гг. было построено и открыто Мариинское убежище (приют) для престарелых сестёр милосердия Красного Креста, которые вследствие потери трудоспособности или по возрасту нуждались в уходе. В убежище был устроен домовый храм во имя равноапостольной Марии Магдалины, настоятелем которого Елизавета Фёдоровна назначила священника Павла Флоренского.