Инициатива открытия на донских землях епархии принадлежала «Секретному комитету о раскольниках», представившему императору Николаю I записку с предложением «повелеть Святейшему Синоду войти в надлежащее рассуждение об открытии новой епископской кафедры в Новочеркасске; причём обратить внимание и на то, не удобнее ли сей же кафедре подчинить и земли черноморских казаков, столь отдалённые от Астрахани, к которой ныне принадлежат». Резолюцией от 30 марта император повелел образовать на этих территориях Донскую и Кавказскую епархию, в результате уточнения она получила название «Новочеркасская и Георгиевская» (по кафедральным городам двух главных областей). 5 апреля 1829 г. доклад Синода о Новочеркасской епархии был окончательно утверждён императором, кафедра была поставлена последней в числе двуклассных епархий, на содержание епископа и духовной консистории было ассигновано 18 491 руб. 32,5 коп., на строительство архиерейского дома с консисторией в Новочеркасске отпущено из казны 14 020 руб. 60,5 коп. Первым архиереем новоучреждённой епархии стал Афанасий (Телятев, с 1830 г. – архиепископ). 15 июня 1829 г. открылась духовная консистория, длительное время состоявшая из четырёх штатных членов. К 1829 г. на Дону действовали 194 церкви, в Кавказской области – 58 церквей и 29 молитвенных домов, в Черномории – 45 церквей и 10 молитвенных домов. По данным ревизии 1835 г., епархиальное духовенство насчитывало: в земле Войска Донского – 593 священнослужителя, в Кавказской области – 267, в Черномории – 138 священнослужителей. Архиепископ Афанасий стремился поднять образовательный уровень духовенства: если в 1839 г. из 520 священников епархии только 32 окончили полный курс семинарии, то в следующем году в епархии служили уже 72 священника с семинарским образованием. Начало церковно-школьного дела в крае связано с деятельностью архиепископа Игнатия (Семёнова): в 1845 г. при новочеркасской Александро-Невской церкви была открыта мужская церковноприходская школа, просуществовавшая до 1882 г., где обучалось от 2 до 2,5 тыс. человек. 14 января 1830 г. открылось епархиальное попечительство о бедных духовного звания. Ко времени управления епархией архиепископом Афанасием относятся явление чудотворной Аксайской иконы Божьей Матери (1830 г.) и первые крестные ходы с ней. В 1832 г. икона по распоряжению архиерея была перенесена из Троицкой церкви станицы Аксайской в Вознесенский кафедральный собор Новочеркасска, в котором она оставалась до 1847 или 1848 г., когда образ был возвращён в станицу Аксайскую. 18 августа 1851 г. император Николай I утвердил определение Синода об учреждении ежегодного крестного хода с чудотворной иконой: из Аксайской станицы в Новочеркасск 13 августа и из Новочеркасска в Аксай 1 октября. Крестный ход был учреждён в благодарность за чудесное избавление от холеры в 1840–1850 гг. В 1859 г. было разрешено заносить чудотворный образ в станицу Кривянскую (1 октября), в 1866 г. – в станицы Бесергеневскую и Заплавскую (4-7 октября), в 1867 г. был разрешён крестный ход в Ростов-на-Дону после праздника Преполовения Пятидесятницы, в 1868 г. – в станицу Старочеркасскую, в 1871 г. получено благословение по пути из Ростова заносить образ в русскую православную церковь в Нахичевани.