В конце XVI – XVII в. неоднократно предпринимались попытки преобразовать львовскую школу в академию, т.е. высшее учебное заведение. В 1597 г. Александрийский патриарх Мелетий Пигас призвал львовян открыть высшую школу, но она так и не была создана. В 1658 г. казаки требовали от польского правительства позволить открыть на Украине две академии – в Киеве и, по-видимому, во Львове. Однако православных опередили иезуиты: в 1661 г. во Львове была создана католическая академия, а существование в одном городе двух высших учебных заведений запрещалось законом. В начале XVII в. школа пришла в упадок в связи с недостатком средств, однако с помощью Кирилла Лукариса в 1616 г. уровень преподавания в ней был восстановлен, в 1619 г. Виленское братство уже вновь просило о присылке учителей из Львова. С конца 1620 гг. преподавание в школе вновь начало ухудшаться из-за гонений со стороны иезуитов и переезда лучших преподавателей школы в более спокойный Киев. Тесные связи львовской школы с Киевской академией сохранялись на протяжении XVII–XVIII вв., несмотря на вхождение Киева в состав России и принятие Львовским братством в 1708 г. унии. Многие ученики львовской школы заканчивали своё образование в Киеве, а затем, вернувшись во Львов, становились там учителями. Львовская школа была закрыта австрийскими властями в 1790 г. Существование виленской школы было утверждено Константинопольским патриархом Иеремией (1588 г.) и привилеем короля Сигизмунда III (1589 г.). В школе почти с самого начала наряду с церковнославянским, греческим и польским языками преподавалась латынь. Расцвет школы приходится на 1590 гг., когда в ней трудились крупнейшие деятели западнорусского просвещения: Стефан и Лаврентий Зизании (Стефан являлся ректором школы до 1596 г.), Кирилл (Транквиллион-Ставровецкий). В начале XVII в. в виленской школе преподавал Мелетий (Смотрицкий), создавший в тот период антиуниатские сочинения «Антиграфэ» (Вильно, 1608 г.) и «Фринос» (Вильно, 1610 г.). До 1608 г. здесь преподавал латынь и греческий язык Леонтий (Карпович), являвшийся также братским типографом и корректором. Среди его учеников славу богослова стяжал Иосиф (Бобрикович), в 1624/1625 гг. – ректор школы (впоследствии епископ Мстиславский). С начала своего существования виленская школа терпела нападки со стороны виленской иезуитской академии (преобразована из коллегии в 1579 г.). В 1598 г. студенты академии учинили разгром братской школы. Однако, несмотря на потерю учителей, школа не прекратила своего существования и оставалась одной из наиболее влиятельных братских школ. Согласно привилею короля Владислава IV (1635 г.), только виленской и киевской школам разрешалось преподавать латынь и греческий. Виленское братство стало во главе всех литературных братств, многие монастыри поступили под протекторат братского монастыря, в том числе могилёвский Богоявленский, Евейский, Купятицкий, Буйничский и др. Братство обязывалось обеспечивать монастыри учителями, которых готовило в своей школе.