Но в 1677 г. патриарх Иоаким отправил в Кашин новую комиссию, осмотревшую мощи княгини и обнаружившую «несогласия» с протоколами осмотра 1649 г., которые, в частности, утверждали, что правая рука княгини сложена двуперстно («правая рука в завитии погнулася, а длань и персты прямо, а не благословляющи»), что использовалось раскольниками как аргумент в пользу своих убеждений. Кроме того, обнаружились многочисленные расхождения между недавно составленными житиями и летописями: так, в новых текстах утверждалось, что Анна была по происхождению не княжной, а боярышней, якобы родилась в Кашине, дата ее смерти была изменена на 30 лет и т.п. Патриарх Иоаким  в 1677 г. созвал в Москве так называемый малый собор архипастырей, который принял решение не почитать Анну как святую, житие и молитвы считать ложными, имя ее исключить из святцев, приделы и церкви, освященные в ее честь, переименовать. Было определено петь по Анне панихиды (а не служить молебны как святой), покров с мощей и иконы с ее изображением доставить в Москву. Собор 1678–1679 гг. подтвердил это решение. Иначе говоря, истинной причиной деканонизации явилось то, что на иконе святая изображалась с рукой, сложенной для двуперстного крестного знамения, которое тогда преследовалось как «армянская ересь». Вместо того чтобы в двуперстии почившей 300 лет назад святой увидеть доказательство равночестности обоих перстосложений и тем самым устранить одно из оснований церковной распри, патриарх Иоаким на соборе, составленном только из лиц иерархии, приостановил чествование св. Анны Кашинской, а ее почитателям пригрозил отлучением от церкви и наказанием. Однако, несмотря на деканонизацию, почитание Анны в Тверской епархии сохранялось, и тверские епископы этому не препятствовали; писались иконы, устраивались крестные ходы к месту прощания Анны с Михаилом Ярославичем, велась запись исцелений (до 1746 г.) и т.п. Уже в 1818 г. Святейший Синод разрешил включить имя Анны в месяцесловы, а в 1899–1901 гг. началась негласная подготовка к восстановлению церковного почитания, в частности, возобновилась запись исцелений и иных чудес, но под  влиянием Победоносцева все было оставлено без последствия. В 1908 г. вопрос о восстановлении церковного почитания Анны Кашинской был снова возбужден 30-ю епископами, съехавшимися в Киев на торжество 800-летия Михайловского Златоверхого монастыря. К ним присоединился киевский миссионерский съезд, а также духовенство и представители земств и граждане городов Кашина и Твери. Синод определением, утвержденным Николаем II 11 апреля 1909 г., разрешил восстановить церковное почитание Анны Кашинской,  назначив для этого 12 июня 1909 г. Синод объявил днем памяти Анны 25 июня н.ст. – годовщину перенесения мощей в 1650 г. В том же 1909 г. в честь Анны Кашинской была освящена церковь в Петербурге, ставшая подворьем Кашинского Сретенского монастыря (с 1992 г. подворье Введено-Оятского монастыря – самого первого русского храма, посвященного этой святой), а в 1914 г. – церковь Серафима Саровского и Анны Кашинской на новом кладбище Донского монастыря в Москве. В наше время Анна Кашинская почитается также в день своей кончины (2 октября ст.ст.) и в Соборе Тверских святых (1-е воскресенье после 29 июня ст.ст.). Во второй половине ХХ в. мощи святой княгини лежали в Церкви Святых Апостолов Петра и Павла. В 2009 г. ее мощи находились для поклонения в Санкт-Петербурге, в церкви Анны Кашинской подворья Введено-Оятского монастыря.